Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil
Summary
Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Batı dünyasında en sık görülen lösemi var. NFAT transkripsiyon faktörleri önemli düzenleyiciler geliştirme ve harekete geçirmek içinde çok sayıda hücre tipleri vardır. Burada, NFAT2, roman hedef genlerin tanımlamak için insan CLL hücrelerinde kromatin immunoprecipitation (ChIP) kullanımı için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Malign B hücre klonlar genişlemesi ile karakterize ve Batı ülkelerinde en sık görülen lösemi temsil eder. CLL hastaların çoğu hastalığın bir tembel seyrini yanı sıra bir anergic fenotip onların lösemi hücrelerinin dış uyarmaya yanıt vermeyen bir B hücre reseptörü atıfta göster. Biz son zamanlarda transkripsiyon faktörü NFAT2 anerji CLL içinde çok önemli bir regülatör olduğunu göstermiştir. Farklı hastalıkların bir transkripsiyon faktör rol analizinde büyük bir sorun, belirli hedef genlerin tanımlamasıdır. Aydınlatma meydana mekanizmaları ve potansiyel terapötik müdahaleler için çok önemli bu. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) protein-DNA etkileşimleri göstermek için klasik bir tekniktir ve bu nedenle, doğrudan hedef genlerin transkripsiyon faktörlerin memeli hücreleri tanımlamak için kullanılabilir. Burada, çip doğrudan hedef gen NFAT2 insan CLL hücrelerinde, LCK tanımlamak için kullanıldı. DNA ve ilişkili proteinler formaldehit kullanarak çapraz ve daha sonra yaklaşık 200-500 baz çifti (bp) DNA parçaları içine sonication tarafından sheared. NFAT2 ile ilişkili çapraz bağlı DNA parçalarının çoğu o zaman seçime bağlı olarak bir αNFAT2 antikor kullanarak hücre artıkları üzerinden immunoprecipitated. Arıtma sonra ilişkili DNA parçalarının nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) yolu ile tespit edilir. DNA dizileri belirgin zenginleştirme ile genom NFAT2 vivo içindetarafından hedef bölgeleri temsil eder. DNA ve gerekli antikor seçimi uygun kesme için bu yöntemin uygulama başarılı özellikle çok önemli. Bu iletişim kuralı NFAT2 doğrudan etkileşim hedef genleri olan gösteri için idealdir. Büyük ölçekli deneyleri birden fazla transkripsiyon faktörleri bozulmamış canlıda hedef genlerin Analizi çip istihdam için zorluk onun büyük kısıtlamadır.
Introduction
CD19, CD23 ve CD5 ayrı birikimi sergilenmesi olgun B ifade1hücreleri, Batı ülkelerinde erişkinlerde en sık görülen lösemi kronik lenfositik lösemi (CLL) temsil eder. Hastaların çoğunda uzun yıllar özel tedavi gerektiren değil bir tembel hastalığı kursu sergi. Buna ek olarak, bazı hastalarda acil tedavi müdahaleler bağışıklık-kemoterapi veya diğer hedefli tedaviler2,3ile gerektiren hızlı ilerleme göster. Nükleer faktör aktive T hücrelerinin (NFAT) transkripsiyon faktörleri çeşitli gelişim kontrol ve harekete geçirmek oluşum içinde çok sayıda hücre türleri4,5,6bir ailedir. Biz son zamanlarda overexpression ve anayasal NFAT2 CLL hücrelerin aktivasyonu hastaların tembel hastalığı7ile gösterdi. Burada, B hücre reseptörü stimülasyon anerji7adı verilen yanıt vermeyen bir durumuna düzenlemektedir. NFAT2 ve lenfosit özel protein Tirozin kinaz (LCK) organizatörü için bağlar LCK ifade insan hücrelerinde CLL, belirli kromatin immunoprecipitation tahlil düzenleyen göstermek için (ChIP) geliştirilen istihdam ve.
Çip transkripsiyon faktörleri gen ifade8‘ rolünü araştırmak için çeşitli teknikler biridir. Gen ifadesinin sıkıca çok karmaşık bir şekilde çeşitli düzenleyici kurumlar tarafından bu işlemi9,10,11,12‘ yeri doldurulamaz bir katılan transkripsiyon faktörleri ile orkestra. Zamansal ve mekansal bağlamda Gen ifadesinin düzenlenmesine transkripsiyon faktörleri çok sayıda türü (Örneğin, kalkınma ve farklılaşma)13,14,15‘tespit edilmiştir, 16,17,18. Transkripsiyon faktörleri içeren karmaşık denetimi düzenekleri hataları patolojik süreçler kanser19,20de dahil olmak üzere çeşitli için yol açabilir. Bu nedenle, transkripsiyon faktörleri ve ilgili hedeflerine kimliği roman tedavi caddeleri21,22sunabilir. Bu ilginç alan araştırmak için çeşitli yöntemler çip, elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil (Emsan), çeşitli DNA açılan deneyleri ve muhabir-deneyleri8,11,12, gibi kullanılabilir 23 , 24.
Belirli bir transkripsiyon faktörü genom belirli bölgeleri ile etkileşim içinde vivo çip bir ideal tekniği25olduğunu göstermektir. Bu amaçla, DNA ve ilişkili proteinler canlı hücreler arasında UV ışınlama veya formaldehit (çapraz bağlı çip, XChIP) kullanarak çapraz bağlı. Bu adım daha iyi DNA ve protein kurtarma sözde yerli çip (NChIP)26içinde elde etmek için atlanır. DNA-protein kompleksleri daha sonra yaklaşık 200-500 baz çifti (bp) ve immunoprecipitated ilgi transkripsiyon faktörü karşı spesifik bir antikor kullanarak hücre artıkları üzerinden parçalara sonication tarafından nın yaşadığı. İlişkili DNA parçalarının sonra saf ve PCR, moleküler klonlama ve sıralama ile karakterize. İmmunoprecipitated DNA analiz için microarrays (ChIP-on-Chip) veya yeni nesil sıralama (ChIP-Seq) alternatif tekniklerini kullanın.
Çip Gilmour tarafından tanıtılan ilk ve ne zaman onlar kullanılan UV 1984 Lis ışık kovalent kullandığında DNA ve yaşam bağlı proteinler bakteriler27. Hücre lizis ve bakteriyel RNA polimeraz immunoprecipitation bilinen genlerin belirli probları RNA polimeraz yoğunluğu ve in vivo dağıtım eşlemek için kullanılmıştır. Yöntemi daha sonra aynı müfettişler tarafından ökaryotik RNA polimeraz II Isı şok protein genlerinde Drosophila28tarihinde dağıtım analiz etmek için kullanıldı. XChIP tahlil daha fazla Varshavsky ve histon H4 Derneği Isı şok protein genler29,30ile çalışmaya cross-linking formaldehit ilk kullanan iş arkadaşlarınızla tarafından rafine. Doğal olarak sağlam epitopları yüzünden daha iyi bir DNA ve protein kurtarma avantajı taşıyan NChIP yaklaşım ve bu nedenle, daha fazla antikor özgüllük, ilk açıklanan Hebbes ve 198831meslektaşları tarafından.
Çip DNA-protein etkileşimleri analiz etmek için diğer teknikleri ile karşılaştırıldığında aslında, transkripsiyon faktörü gerçek etkileşim incelenen vivo içinde ve hiçbir sondalar olabilir veya yapay koşullar arabellekleri veya jeller tarafından oluşturulan avantajdır 8,11,12istihdam. ChIP yeni nesil sıralama ile birleştirerek, birden çok hedef aynı anda belirlenebilir.
Bu tekniğin büyük sınırlamalar olduğu gibi organizmalar25büyük ölçekli deneyleri kendi sınırlı uygulanabilirliği vardır. Fark gen ifade desenleri analiz de ilgili proteinler düşük seviyelerde sadece ya da dar zaman pencereleri sırasında gösterilir Eğer çip teknikleri kullanarak zor olabilir. Başka bir potansiyel olarak sınırlayıcı faktör çip11için uygun uygun bir antikor durumu olduğunu.
Burada sunulan çip Protokolü hedef genlerin transkripsiyon faktörü in vivo tanımlanması için nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) tarafından istihdam edilecek. Özellikle, yeni hedef genler CLL NFAT2 tanımlamak için hedefi oldu. Çip doğrudan NFAT2 bağlama organizatörü bölgelere farklı hedef genlerin insan CLL hasta hücrelerinde doğal koşullar altında göstermek için potansiyel nedeniyle seçildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı bir çip tahlil yapmak kritik uygun bir antikor yelpazesi ve kesme işlemi25kromatin optimizasyonu adımlardır. ΑNFAT2 antikor seçimini bu protokolü geliştirilmesi sırasında özellikle zor olduğu ortaya çıktı. Birkaç αNFAT2 antikorlar piyasada bulunan ve western Blot için bu inşaat para cezası ve diğer uygulamaların çoğunluğu olmakla birlikte, klon 7A6 başarıyla ChIP7için kullanılan tek antikor yapıldı. Hatta sözde aynı 7A6 antikorla…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser DFG tarafından desteklenen MU 3340/1-1 ve Deutsche Krebshilfe vermek 111134 (her ikisi de M.R.M. için layık) verin. Elke Malenke mükemmel teknik destek için teşekkür ediyoruz).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Referenzen
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Entwicklungsbiologie. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), 831-832 (2007).
