慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法
Summary
慢性リンパ性白血病 (CLL) は西部の世界で最も一般的な白血病です。NFAT 転写因子は、開発と様々 な細胞タイプにおける活性化の重要なレギュレータです。NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するために CLL 細胞のクロマチン免疫沈降 (チップ) の使用のためのプロトコルを紹介します。
Abstract
慢性リンパ性白血病 (CLL) と悪性 B 細胞のクローンの拡張によって特徴付けられる欧米で最も一般的な白血病を表します。CLL の患者の大半は病気の怠惰なコースだけでなく、白血病細胞アネルギーの表現型を表示し、B 細胞受容体の外部刺激に応答を参照します。我々 は最近、CLL のアネルギーの重要な調節因子である転写因子 NFAT2 を示しています。さまざまな病気における転写因子の役割の解析における主要な課題は、その特定のターゲット遺伝子の id です。これは発病メカニズムと潜在的な治療上の介在の解明にとって重要なのです。クロマチン免疫沈降 (チップ) 蛋白質 DNA の相互作用を示すための古典的な手法は、したがって、哺乳類細胞における転写因子の標的遺伝子を識別するために使用できる、.ここでは、チップは、CLL 細胞における NFAT2 の直接の標的遺伝子としてLCKを識別するために使用されました。DNA と関連するタンパク質架橋ホルムアルデヒドを使用して、その後約 200-500 塩基対 (bp) の DNA 断片に超音波処理によるせん断。NFAT2 に関連付けられた架橋の DNA のフラグメントが、選択的に αNFAT2 抗体を用いた細胞の残骸から沈澱。浄化後関連付けられている DNA のフラグメントは量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) によって検出されます。明らか濃縮 DNA シーケンスは、生体内でNFAT2 がターゲットにしているゲノムの領域を表しています。DNA と必要な抗体の選択の適切な剪断がこのメソッドの成功のアプリケーションのため特に重要です。このプロトコルは NFAT2 の標的遺伝子との直接相互作用のデモに最適です。その主要な制限は、そのまま生物における複数の転写因子のターゲット遺伝子を分析大規模な試金でチップを採用するが困難です。
Introduction
CD5、CD23、CD19 の明確な蓄積を展示表現成熟 B 細胞1、慢性リンパ性白血病 (CLL) は、欧米の成人の最も一般的な白血病を表します。ほとんどの患者は、長年にわたり特定の治療を必要としない怠惰病コースを展示します。対照的に、何人かの患者は、免疫化学療法または他の目標とされた療法2,3で即時の治療的介入を必要とする急速な進行を示します。活性化 T 細胞 (NFAT) の核因子は様々 な発達を制御する転写因子と多数のセル型4,5,6活性化プロセスの家族です。我々 は最近怠惰病7患者の過剰発現と CLL 細胞における NFAT2 の憲法活性化を示した。ここでは、それはアネルギー7と呼ばれる B 細胞受容体刺激に応答していない状態を調節します。NFAT2 リンパ球特定の蛋白質のチロシンのキナーゼ (LCK) プロモーターに結合しを CLL 細胞特定のクロマチン免疫沈降分析におけるLCKの発現を調節することを示す (チップ) を開発、採用します。
チップは8遺伝子発現における転写因子の役割を調査するいくつかのテクニックのひとつです。遺伝子発現はしっかりと演出した非常に複雑な方法でいくつかの規制当局がこのプロセス9,10、11,12かけがえのない参加転写因子。多数種 (例えばの開発と分化)13,14,15、時空のコンテキストにおける遺伝子発現を調節する転写因子が同定されています。 16,17,18。転写因子が関与する複雑な制御機構でのエラーは、がん19,20を含む病理学的プロセスの様々 な可能性があります。したがって、転写因子とそのそれぞれのターゲットの同定は、新しい治療の道21,22を提供しています。チップ、ゲルシフトアッセイ (EMSA)、様々 な DNA プルダウン ・ アッセイ、レポーターの試金8,11,12,のようないくつかの方法がありますこの興味をそそられる分野を調査するには23,24。
特定の転写因子がゲノムの特定の地域と対話することを実証するには、生体内で、チップは理想的な手法25です。このため、DNA と細胞内タンパク質関連は紫外線照射またはホルムアルデヒド (架橋チップ、XChIP) を使用して架橋します。良い DNA とタンパク質の回収いわゆるネイティブ チップ (NChIP)26を取得するこの手順は省略されます。DNA 蛋白質の複合体はその後 200-500 の塩基対 (bp) および興味の転写調節因子に対する特異抗体を用いた細胞の残骸から沈澱の断片に sonication によって毛を刈る。関連付けられている DNA のフラグメントは精製し、PCR、分子クローニングおよび順序によって特徴付けられます。代替技術は、沈澱の DNA を分析するのに (チップ ・ オン ・ チップ) のマイクロ アレイや次世代シーケンス (チップ Seq) を使用します。
チップ ギルモア初と UV を使用時 1984 年に Lis クロスリンク DNA 共有結合する光し体内蛋白質をバインド細菌27。セル換散、細菌 RNA ポリメラーゼの免疫沈降の時に知られていた遺伝子の特定のプローブは体内分布と RNA ポリメラーゼの密度をマップする使用されました。メソッドは、熱ショック蛋白質遺伝子ショウジョウバエ28の真核生物の RNA ポリメラーゼ II の分布を分析する同じ捜査官によってその後使用されました。XChIP アッセイは、・ バーシャフ スキーと最初熱ショック蛋白質遺伝子29,30とヒストン H4 の関連を研究する架橋ホルムアルデヒドを使用した同僚によってさらに洗練されました。NChIP のアプローチは、自然そのままのエピトープによるより良い DNA および蛋白質の回復の利点を運ぶと、したがってより抗体の特異性は、最初 Hebbes と 1988年31同僚によって記述されていた。
DNA 蛋白質の相互作用を分析する他の技術と比較してチップの利点は、実際には、転写因子の実際の相互作用は調査生体内でないプローブすることができます、バッファーまたはゲルによって作成された人工の条件8、11,12を採用しました。次世代シーケンサーとチップを組み合わせて、複数のターゲットを同時に識別できます。
この技術の主要な制限は、そのまま生物25大規模の試金への限られた適用性です。差動遺伝子発現パターンの解析は、低レベルでのみまたは狭い時間帯にそれぞれの蛋白質を表現する場合、チップの技術を使用してやりがいのあることができます。別の可能性のある要因は、チップ11適して適切な抗体の可用性です。
定量的リアルタイム PCR (qRT PCR) による転写因子の標的遺伝子を生体内で識別するためここで示したチップ プロトコルを使用できます。具体的には、目標は、CLL の NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するためにだった。チップは、直接細胞 CLL 患者の自然な条件の下で別のターゲット遺伝子のプロモーター領域の NFAT2 結合を示す潜在性のために選ばれました。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功したチップ試金の実行の重要なステップは、適切な抗体の選択とプロセス25をせん断クロマチンの最適化です。ΑNFAT2 抗体の選択は、このプロトコルの開発時に特に難しいことがわかった。市販のいくつかの αNFAT2 抗体と西部にしみが付くことの罰金これらの作品や他のアプリケーションの大半が、クローン 7A6 だったチップ7正常に使用できる唯一の抗…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、DFG によって支えられた MU 3340/1-1 およびドイツ Krebshilfe 付与 111134 (M.R.M. に授与の両方) を付与します。ありがとうエルケ Malenke 優れたテクニカル サポート)。
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Referenzen
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