Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar Genes-alvo NFAT2 novela em leucemia linfocítica crônica
Summary
Leucemia linfocítica crônica (CLL) é a leucemia mais comum no mundo ocidental. Fatores de transcrição NFAT são importantes reguladores do desenvolvimento e ativação em numerosos tipos de células. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) em células humanas de CLL identificar genes alvo romance de NFAT2.
Abstract
Leucemia linfocítica crônica (CLL) é caracterizada pela expansão dos clones de células malignas de B e representa a leucemia mais comum em países ocidentais. A maioria dos pacientes CLL mostra um curso indolente da doença, bem como um fenótipo anérgicas das suas células de leucemia, referindo-se a um receptor de células B não responde a estímulos externos. Nós recentemente têm mostrado que o fator de transcrição NFAT2 é um regulador essencial de anergy em CLL. Um grande desafio na análise do papel do fator de transcrição em diferentes doenças é a identificação de seus genes-alvo específicos. Isto é de grande importância para a elucidação dos mecanismos moleculares e possíveis intervenções terapêuticas. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma técnica clássica para demonstrar as interações proteína-ADN e pode, portanto, ser usada para identificar genes-alvo direto de fatores de transcrição em células de mamíferos. Aqui, o ChIP foi usado para identificar LCK como um gene alvo direto de NFAT2 em células humanas de CLL. DNA e proteínas associadas são quitosana utilizando formaldeído e posteriormente cortado pelo sonication em fragmentos de DNA de cerca de 200-500 de pares de bases (bp). Reticulado fragmentos de DNA associados com NFAT2 então são seletivamente immunoprecipitated de detritos celulares usando um anticorpo αNFAT2. Após a purificação, fragmentos de DNA associados são detectados através de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Sequências de DNA, com evidente enriquecimento representam regiões do genoma que são alvo de NFAT2 na vivo. Corte adequado de DNA e a seleção do anticorpo necessário são particularmente crucial para o sucesso da aplicação desse método. Este protocolo é ideal para a manifestação de interações diretas de NFAT2 com genes-alvo. Sua principal limitação é a dificuldade de empregar o ChIP em ensaios em grande escala, analisando os genes alvo de múltiplos fatores de transcrição em organismos intactos.
Introduction
Leucemia linfocítica crônica (CLL) representa a leucemia mais comum em adultos nos países ocidentais, exibindo distinto acúmulo de CD5, CD23 e CD19 expressar B maduro células1. A maioria dos pacientes apresentam um curso de doença indolente, que não necessita tratamento específico por muitos anos. Pelo contrário, alguns pacientes mostram progressão rápida, que exigem intervenções terapêuticas imediatas com imune-quimioterapia ou outras terapias alvo2,3. Fator nuclear das células T ativadas (NFAT) é uma família de factores de transcrição, controlando vários no desenvolvimento e processos de ativação em numerosas células tipos4,5,6. Recentemente demonstramos superexpressão e ativação constitucional de NFAT2 nas células CLL de pacientes com doença indolente7. Aqui, regula um estado sem resposta à estimulação do receptor de células B chamado anergy7. Para demonstrar que o NFAT2 vincula-se à promotora linfócitos específicos da proteína tirosina quinase (LCK) e regula a expressão LCK em células humanas CLL, um ensaio de imunoprecipitação de cromatina específico (ChIP) foi desenvolvido e empregado.
ChIP é uma das várias técnicas para investigar o papel de factores de transcrição do gene expressão8. Expressão gênica é firmemente orquestrada de uma forma muito complexa por vários reguladores com fatores de transcrição, levando uma parte insubstituível deste processo9,10,11,12. Fatores de transcrição que regulam a expressão do gene em um contexto espacial e temporal foram identificadas em várias espécies (por exemplo, para o desenvolvimento e diferenciação)13,14,15, 16,17,18. Erros nos mecanismos de controle intrincadas envolvendo fatores de transcrição podem levar a uma variedade de processos patológicos, incluindo câncer19,20. Daí, identificação de fatores de transcrição e seus respectivos destinos pode oferecer novas avenidas terapêutico21,22. Para investigar este campo intrigante vários métodos estão disponíveis como ChIP, ensaio de turno de mobilidade electrophoretic (EMSA), vários ensaios suspensos de DNA e repórter-ensaios de11,8,12, 23 , 24.
Para demonstrar que um determinado fator de transcrição interage com regiões específicas do genoma in vivo ChIP é uma técnica ideal25. Para este efeito, DNA e proteínas associadas em células vivas são reticuladas utilizando irradiação UV ou formaldeído (ChIP reticulado, XChIP). Esta etapa é omitida para obter melhor DNA e proteína recuperação em nativo chamado ChIP (NChIP)26. Os complexos DNA-proteína são posteriormente cortados pelo sonication em fragmentos de aproximadamente 200-500 pares de bases (bp) e immunoprecipitated a partir dos escombros de célula, usando um anticorpo específico contra o fator de transcrição de interesse. Os fragmentos de DNA associados são então purificados e caracterizados por PCR, clonagem molecular e sequenciamento. Técnicas alternativas usam microarrays (ChIP-on-Chip) ou o sequenciamento de nova geração (ChIP-Seq) para analisar o DNA de immunoprecipitated.
Microplaqueta foi introduzido pela primeira vez por Gilmour e Lis em 1984 quando usaram UV e luz covalentemente ligação transversal DNA e ligado a proteínas na vida bactérias27. Após a lise celular e imunoprecipitação de bacteriana RNA polimerase, sondas específicas de genes conhecidos foram usadas para mapear a distribuição na vivo e densidade da RNA polimerase. O método foi posteriormente usado pelos mesmos investigadores para analisar a distribuição dos eucariota RNA polimerase II em genes de proteínas de choque térmico em Drosophila28. O ensaio de XChIP aperfeiçoado por Varshavsky e colegas de trabalho que primeiro usou o cross-linking para estudar a associação de histona H4 com calor choque proteína genes29,30de formaldeído. A abordagem NChIP, que leva a vantagem de uma melhor recuperação de DNA e proteína devido a epitopos naturalmente intactas e, portanto, maior especificidade do anticorpo, foi primeiramente descrito por Hebbes e colegas em 198831.
A vantagem do ChIP em comparação com outras técnicas para analisar interações da ADN-proteína na verdade, é que a interação real de um factor de transcrição pode ser investigado in vivo e sem sondas ou condições artificiais criadas pelos buffers ou géis empregado de11,8,12. Combinando o ChIP com o sequenciamento de nova geração, podem ser identificados múltiplos alvos simultaneamente.
Principais limitações desta técnica são a sua aplicabilidade limitada para ensaios em grande escala em organismos intactos25. A análise de padrões de expressão diferencial do gene também pode ser desafiador, usando técnicas de ChIP, se as respectivas proteínas são expressas somente em níveis baixos ou durante as janelas de tempo estreita. Outro fator potencialmente limitante é a disponibilidade de um anticorpo adequado adequado para o ChIP11.
O protocolo de ChIP aqui apresentado pode ser empregado para identificação de genes-alvo de um fator de transcrição na vivo por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Especificamente, o objetivo era identificar genes alvo romance de NFAT2 em CLL. Microplaqueta foi escolhida devido ao seu potencial para demonstrar diretamente a vinculação de NFAT2 para as regiões de promotor dos genes-alvo diferente em condições naturais no pacientes células CLL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos críticos da realização de um ensaio da microplaqueta bem-sucedida estão a seleção de um anticorpo adequado e a otimização da tosquia processo25a cromatina. A seleção do anticorpo αNFAT2 provou para ser particularmente desafiador durante o desenvolvimento do presente protocolo. Embora existam vários anticorpos αNFAT2 comercialmente disponíveis e a maioria destes funciona bem para a mancha ocidental e outras aplicações, clone 7A6 foi o único anticorpo que pode ser usado co…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo DFG conceder MU 3340/1-1 e a Deutsche Krebshilfe concedem 111134 (ambos premiados para M.R.M.). Agradecemos Elke Malenke pela excelente assistência técnica).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Referenzen
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