Een chromatine Immunoprecipitation Assay te identificeren van roman NFAT2 doelgenen in chronische lymfatische leukemie
Summary
Chronische lymfatische leukemie (CLL) is de meest voorkomende leukemie in de westerse wereld. NFAT transcriptiefactoren zijn belangrijk regulatoren van ontwikkeling en activering in vele celtypes. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van chromatine immunoprecipitation (ChIP) in menselijke CLL cellen te identificeren roman doelgenen van NFAT2.
Abstract
Chronische lymfatische leukemie (CLL) wordt gekenmerkt door de groei van kwaadaardige B-cell klonen en vertegenwoordigt de meest voorkomende leukemie in westerse landen. De meerderheid van CLL patiënten tonen een vadsig verloop van de ziekte en het fenotype van een anergic van hun leukemie cellen, verwijzend naar een B-cel receptor niet reageert op externe stimulatie. We hebben onlangs aangetoond dat de transcriptiefactor NFAT2 een belangrijke regulator van de anergie in CLL is. Een grote uitdaging in de analyse van de rol van een transcriptiefactor in verschillende ziekten is de identificatie van haar specifieke doelgenen. Dit is van groot belang voor de opheldering van pathogenetische mechanismen en potentiële therapeutische interventies. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een klassieke techniek om aan te tonen van eiwit-DNA interacties en kan daarom worden gebruikt om te identificeren directe doelgenen van transcriptiefactoren in zoogdiercellen. Hier, was ChIP gewend LCK identificeren als een directe doel-gen van NFAT2 in menselijke cellen van CLL. DNA en geassocieerde eiwitten zijn kruisverwijzende met formaldehyde en vervolgens geschoren met het ultrasoonapparaat in DNA-fragmenten van ongeveer 200-500 basenparen (bp). Kruislings gekoppelde DNA-fragmenten die zijn gekoppeld aan de NFAT2 zijn dan selectief immunoprecipitated uit het puin van de cel met behulp van een antilichaam αNFAT2. Na zuivering, worden de bijbehorende DNA-fragmenten gedetecteerd via kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). DNA-sequenties met duidelijk verrijking vertegenwoordigen regio’s van het genoom die het doelwit van NFAT2 in vivo. Passende afknippen van het DNA en de selectie van het vereiste antilichaam zijn van bijzonder groot belang voor de succesvolle toepassing van deze methode. Dit protocol is ideaal voor de demonstratie van directe interacties van NFAT2 met doelgenen. De belangrijkste beperking is de moeilijkheid om de ChIP in grootschalige testen analyseren van de doelgenen van meerdere transcriptiefactoren in intact organismen in dienst.
Introduction
Chronische lymfatische leukemie (CLL) vertegenwoordigt de meest voorkomende leukemie bij volwassenen in de westerse landen, vertonen verschillende accumulatie van CD19, CD23 en CD5 uitdrukken van de rijpe B cellen1. De meeste patiënten vertonen een cursus vadsig ziekte, die geen specifieke behandeling voor vele jaren geïmplementeerde vergt. Sommige patiënten Toon daarentegen snelle progressie vereisen onmiddellijke therapeutische interventies met immuun-chemotherapie of andere gerichte therapieën2,3. Nucleaire factor van geactiveerde T-cellen (NFAT) is een familie van transcriptiefactoren beheersing van verschillende ontwikkelings- en activering processen in talrijke cel typen4,5,6. We toonden onlangs overexpressie en constitutionele activering van NFAT2 in CLL cellen van patiënten met vadsig ziekte7. Hier, regelt het een niet-reagerende staat aan B-cel receptor stimulatie anergie7genoemd. Om aan te tonen dat NFAT2 aan de organisator van lymfocyt-specifieke proteïne tyrosine kinase (LCK bindt) en LCK expressie in menselijke CLL cellen, een specifieke chromatine immunoprecipitation assay regelt werd (ChIP) ontwikkeld en ingezet.
ChIP is een van de verschillende technieken voor het onderzoeken van de rol van transcriptiefactoren in gen expressie8. Genexpressie is strak georkestreerd in een zeer complexe wijze door verschillende regelgevers met transcriptiefactoren een onvervangbaar deel te nemen aan dit proces9,10,11,12. Transcriptiefactoren regulering van de expressie van genen in een ruimtelijke en temporele context geconstateerd in talrijke soorten (bijvoorbeeld voor ontwikkeling en differentiatie)13,14,15, 16,17,18. Fouten in de ingewikkelde controlemechanismen waarbij transcriptiefactoren kunnen leiden tot een verscheidenheid van pathologische processen waaronder kanker19,20. Vandaar, identificatie van transcriptiefactoren en hun respectieve doelstellingen kan bieden nieuwe therapeutische mogelijkheden21,22. Om te onderzoeken van dit intrigerende veld zijn verschillende methoden beschikbaar, zoals de ChIP, elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA), verschillende DNA pull-down testen en verslaggever-assays8,11,12, 23 , 24.
Om aan te tonen dat een bepaalde transcriptiefactor met specifieke regio’s van het genoom interageert is in vivo ChIP een ideale techniek25. Voor dit doel, DNA en geassocieerde eiwitten in levende cellen worden kruiselings gekoppelde met behulp van UV-bestraling of formaldehyde (kruislings gekoppelde ChIP, XChIP). Deze stap wordt weggelaten om betere DNA en eiwit herstel in de zogenaamde native ChIP (NChIP)26te verkrijgen. De DNA-eiwitcomplexen worden vervolgens geschoren met het ultrasoonapparaat in stukjes van ongeveer 200-500 basenparen (bp) en immunoprecipitated uit het puin van de cel met behulp van een specifiek antilichaam tegen de transcriptiefactor van belang. De bijbehorende DNA-fragmenten zijn vervolgens gezuiverd en gekenmerkt door PCR, moleculaire klonen en rangschikken. Alternatieve technieken microarrays (ChIP-on-Chip) of de volgorde van de volgende generatie (ChIP-Seq) gebruiken voor het analyseren van de immunoprecipitated van DNA.
ChIP voor het eerst werd geïntroduceerd door Gilmour en Lis in 1984 toen ze UV gebruikt licht aan covalent kruislings gekoppelde DNA en eiwitten gebonden in levende bacteriën27. Lysis van de cel en immunoprecipitation van bacteriële RNA polymerase, werden specifieke sondes van bekende genen gebruikt om de in vivo distributie en de dichtheid van RNA polymerase kaart. De methode werd later gebruikt door de dezelfde onderzoekers voor het analyseren van de verdeling van eukaryotische RNA polymerase II op warmte schok eiwit genen bij Drosophila28. De bepaling van de XChIP werd verder verfijnd door Varshavsky en collega’s die voor het eerst gebruikt formaldehyde dwarsbinding om te bestuderen van de vereniging van Histon H4 met warmte schok eiwit genen29,30. De NChIP benadering, die het voordeel van een betere DNA en eiwit herstel als gevolg van natuurlijk intact epitopes draagt en dus meer antilichamenspecificiteit, voor het eerst werd beschreven door Hebbes en collega’s in 198831.
Het voordeel van ChIP in vergelijking met andere technieken voor het analyseren van DNA-eiwit interactie is in feite dat de werkelijke interactie van een transcriptiefactor onderzocht in vivo en geen sondes worden kan of kunstmatige omstandigheden gemaakt door buffers of gels 8,11,12in dienst. Door het combineren van ChIP met next-generation sequencing, kunnen meerdere doelen tegelijk worden geïdentificeerd.
Belangrijke beperkingen van deze techniek zijn de beperkte toepasbaarheid voor grootschalige testen in intact organismen25. De analyse van differentiële gen-expressiepatronen kunnen ook uitdagende met behulp van de ChIP technieken als de respectieve eiwitten worden uitgedrukt, alleen op een laag niveau of tijdens smalle tijd windows. Een ander potentieel beperkende factor is de beschikbaarheid van een passende antilichaam geschikt voor ChIP11.
Het protocol van de ChIP hier gepresenteerd kan worden gebruikt voor de identificatie in vivo van doelgenen van een transcriptiefactor door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). Specifiek, was het doel om het identificeren van de roman doelgenen van NFAT2 in CLL. ChIP werd gekozen omwille van zijn potentieel te tonen direct de binding van NFAT2 aan de promotor regio’s van verschillende doelgenen onder natuurlijke omstandigheden in menselijke CLL patiënt cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritische stappen voor het uitvoeren van een succesvolle ChIP test zijn de selectie van een geschikte antilichaam en de optimalisatie van de chromatine proces25schuintrekken. De selectie van het antilichaam αNFAT2 bleek bijzonder uitdagende tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Hoewel er verschillende αNFAT2 antilichamen verkrijgbare en de meerderheid van deze werkt prima voor het westelijke bevlekken en andere toepassingen, was kloon 7A6 de enige antilichaam dat met succes kan worden geb…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de DFG verlenen MU 3340/1-1 en de Deutsche Krebshilfe verlenen 111134 (beide toegekend aan M.R.M.). Wij danken Elke Malenke voor uitstekende technische bijstand).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Referenzen
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Entwicklungsbiologie. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), 831-832 (2007).
