الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران
Summary
هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا وأنسجة الدماغ، وذلك باستخدام تلطيخ الفلورة المناعية وطرق الحمض النووي نقطة لطخة.
Abstract
وقد تم تحديد تعديلات الحمض النووي متعددة في الجينوم الثدييات. ومن هذا السبب، تمت دراسة الآليات الجينية بوساطة 5-ميثيل سيتوسين و5-هيدروكسي ميثيل السيتوسين بوساطة مكثفة. 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين يعرض السمات الديناميكية أثناء النمو الجنيني وبعد الولادة في الدماغ، ويلعب وظيفة تنظيمية في التعبير الجيني، ويشارك في اضطرابات عصبية متعددة. هنا، ونحن نصف الطرق التفصيلية بما في ذلك تلطيخ الفلورة المناعية والحمض النووي نقطة وصمة عار للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيلسيتوسين في الخلايا المستزرعة وأنسجة الدماغ من الماوس.
Introduction
وقد ثبت التعديلات الجيني، بما في ذلك تعديل الحمض النووي، وتعديل الهيستون وتعديل الحمض النووي الريبي، للعب وظائف أساسية في العمليات البيولوجية المتنوعة والأمراض1،2،3، 4 , 5 , 6 , 7– ولفترة طويلة، اعتُبر مثيلة الحمض النووي (أي 5-ميثيلسيتوسين (5-م.م)) علامة جينية مستقرة للغاية ولا يمكن تعديلها مرة أخرى في الجينوم. في الآونة الأخيرة، تم العثور على أن 5-mC يمكن أكسدة إلى 5-هيدروكسي ميثيلسيتوسين (5-hmC) من قبل TET (10-11 translocations) البروتينات العائلية بما في ذلك TET1، TET2، وTET38،9. وتظهر دراسات أخرى أن 5-hmC يمكن أن تكون بمثابة علامة مستقرة ولعب الأدوار البيولوجية من خلال تنظيم التعبير الجيني4،10،11،12.
وتشير الأدلة الحالية إلى أن 5-hmC هو المخصب للغاية في الأنسجة العصبية / الخلايا بالنسبة لأنواع أخرى من الأنسجة في الثدييات، ويعرض الميزات الديناميكية خلال تطوير الخلايا العصبية13،14. في الجهاز العصبي، 5-hmC بوساطة التعديلات الجينية تلعب دورا هاما في تنظيم الخلايا الجذعية العصبية، والنشاط العصبي، والتعلم والذاكرة، وتشارك في اضطرابات عصبية متعددة بما في ذلك متلازمة ريت، التوحد، الزهايمر المرض، مرض هنتنغتون، الخ2،13،15،16،17،18،19،20.
هناك العديد من النهج للكشف عن 5-hmC في الخلايا والأنسجة14،21،22،23،24. هنا، ونحن نصف طريقتين للكشف عن وجود 5-hmC وكمية المستوى العالمي من 5-hmC: تلطيخ الفلورة المناعية والحمض النووي نقطة وصمة عار. هذه الطريقتين مريحة وحساسة، وقد استخدمت بنجاح في الدراسات السابقة25،26،27،28،29،30. الخطوات الرئيسية لهذين الأسلوبين هي إزالة الحمض النووي. لتلطيخ مناعة 5-hmC، مطلوب المعالجة المسبقة للعينات مع 1 M حمض الهيدروكلوريك. ل5-hmC نقطة وصمة عار، يتم تنفيذ denaturation الحمض النووي مع حل هيدروكسيد الصوديوم. هذه الطريقتين جنبا إلى جنب مع تسلسل الجيل القادم هي أدوات مفيدة جداً للتحقيق في وظيفة 5-hmC.
Protocol
Representative Results
Discussion
تلعب التعديلات الجينيّة أدوارًا أساسية أثناء نمو الدماغ والنضج والوظيفة. كعلامة مستقرة لتعديل الحمض النووي, دينامية 5-hmC يستجيب للتكيف السلوكي, النشاط العصبي, ويرتبط بشكل إيجابي مع التعبير الجيني; وبالتالي، فإنه يشارك في الوظيفة الطبيعية للدماغ والاضطراب العصبي4. لاستكشاف وظ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم XL جزئيا من قبل البرنامج الوطني لالبحث والتطوير مفتاح الصين (2017YFE0196600)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 31771395، 31571518). تم دعم Q.S. من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFC1001703) وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي لمقاطعة تشجيانغ (2017C03009). تم دعم W.X. من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (LY18H020002) وقسم التكنولوجيا العلمية في مقاطعة تشجيانغ (2017C37057).
Materials
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 |
| epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B |
| forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 |
| neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 |
| nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B |
| OCT | Leica | 14020108926 |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 |
| phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 |
| proteinase K | VVR | 39450-01-6 |
| retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
Referenzen
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
- Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
- Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
- Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
- Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
- Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , 245-254 (2003).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer’s disease. BMC Genomics. 17, (2016).
- Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
- Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer’s disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
- Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
- Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
- Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
- Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
- Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
- Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
- Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
- Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
- Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
