Summary

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

Published: September 19, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים ורקמות המוח, ניצול immunofluorescence כתמים ושיטות כתמי נקודה DNA.

Abstract

שינויי דנ א מרובים זוהו בגנום היונקים. מתוך זה, 5-מתילציטוסין ו-5-הידרוגרד מתילציטוסין-בתיווך מנגנונים גנטיים נחקרו באופן אינטנסיבי. 5-hydroxyמתילציטוסינוס מציג תכונות דינמיות במהלך פיתוח המוח העובריים והפוסט-לידתיים, משחק תפקיד רגולטורי בביטוי הגנים, והוא מעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות. כאן, אנו מתארים את השיטות המפורטות כולל כתמים immunofluorescence ו-DNA נקודה-כתם כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים מתורבתים ורקמות המוח של העכבר.

Introduction

שינויים אפיגנטיים, כולל שינוי ה-DNA, שינוי היסטון ו-RNA שינוי, הוכחו לשחק פונקציות חיוניות בתהליכים ביולוגיים שונים ומחלות1,2,3, ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. במשך זמן רב, מתילציה DNA (כלומר, 5-מתיל ציטוסין (5-mC)) הוצג כסמן מאוד יציב אפיגנטי ולא ניתן לשנות עוד בגנום. לאחרונה, זה נמצא כי 5-mC יכול להיות תחמוצת ל 5-הידרוxyמתילציטוסין (5-hmc) על ידי ט (10-11 טרנסמקומות) משפחה חלבונים כולל TET1, TET2, ו TET38,9. מחקרים נוספים מראים כי 5-hmc יכול לשמש סמן יציב ולשחק תפקידים ביולוגיים באמצעות ויסות גן ביטוי4,10,11,12.

הראיות הקיימות מצביעות על כך 5-hmc הוא מועשר מאוד ברקמות הנוירואליות/תאים ביחס לסוגים אחרים של רקמות יונקים, ומציג תכונות דינמיות במהלך פיתוח עצבי13,14. במערכת עצביים, 5-hmC בתיווך אפיגנטי שינויים לשחק תפקיד חשוב בוויסות תאי גזע עצביים, פעילות עצבית, למידה וזיכרון, והוא מעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות כולל תסמונת רט, אוטיזם, אלצהיימר מחלה, מחלת הנטינגטון, וכו ‘2,13,15,16,17,18,19,20.

ישנן מספר גישות לגילוי 5-hmc בתאים ורקמות14,21,22,23,24. כאן, אנו מתארים שתי שיטות כדי לזהות את קיומו של 5-hmC ולכמת את הרמה הגלובלית של 5-hmC: מכתים החיסונית של כתמים ו-DNA נקודה-כתם. שתי שיטות אלה הן נוחות ורגישות, ובשימוש בהצלחה במחקרים קודמים25,26,27,28,29,30. השלבים העיקריים של שתי שיטות אלה הם denaturation DNA. עבור מכתים החיסונית של 5-hmC, טרום טיפול של דגימות עם HCl 1 M נדרש. עבור 5-hmC נקודה-כתם, דנ א הדנטורציה מבוצעת עם פתרון NaOH. שתי שיטות אלה יחד עם רצף הדור הבא הם כלים שימושיים מאוד לחקירת הפונקציה של 5-hmC.

Protocol

כל ההליכים בעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת ג’ה-ג’יאנג. 1. התרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים ונוירונים בידוד בתאי גזע עצביים מבוגרים מן המוח הקדמי של מבוגר (8-10 בן שבוע) C57/BL6 עכבר זכר כמתואר בעבר31,32. תרבות ת…

Representative Results

כדי לחשוף את ההתפלגות של 5-hmC בהיפוקמפוס של עכברים למבוגרים, ביצעו immunofluorescence עם נוגדנים נגד תאים עצביים (NeuN) ו 5-hmC. בהיפוקמפוס, 5-hmC שיתוף מקומי היטב עם סמן תא עצבי NeuN (איור 1A-H), המציעה העשרה של 5-hmc ב נוירונים. כדי לקבוע את הדינמיקה של 5-hmC במהלך התפתחות עצב?…

Discussion

שינויים אפיגנטיים לשחק תפקידים חיוניים במהלך התפתחות המוח, התבגרות, ותפקוד. כסמן יציב עבור שינוי DNA, דינמי 5-hmC מגיב לעיבוד התנהגותי, פעילות עצבית, והוא מתואם באופן חיובי עם ביטוי גנים; לכן, הוא מעורב בתפקוד תקין של המוח והפרעה נוירולוגית4. כדי לחקור את תפקידה בתאים ורקמות, יש צור…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

XL היה נתמך בחלק על ידי תוכנית הלאומית R & D של סין (2017YFE0196600), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט Nos. 31771395, 31571518). Q.S. היה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (2017YFC1001703) ואת תוכנית מחקר ופיתוח מפתח של פרובינצית ג’ה-ג’יאנג (2017C03009). W.X. היה נתמך על ידי הקרן המדע הטבעי של מחוז ג’ה-ג’יאנג (LY18H020002) ואת טכנולוגיית המדע של מחוז ג’ה-ג’יאנג (2017C37057).

Materials

4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
neurobasal medium Gibco 21103-049
normal goat serum Vector Laboratories Z0325
nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
proteinase K VVR 39450-01-6
retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210

Referenzen

  1. Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
  2. Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
  3. Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
  4. Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
  5. Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
  6. Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
  7. Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
  8. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  9. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  10. Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
  11. Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
  12. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , 245-254 (2003).
  13. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
  14. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  15. Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer’s disease. BMC Genomics. 17, (2016).
  16. Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
  17. Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer’s disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
  18. Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
  19. Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
  20. Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
  21. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  22. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  23. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  24. Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
  25. Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
  26. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  27. Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
  28. Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
  29. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
  30. Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
  31. Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
  32. Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
  33. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
check_url/de/59950?article_type=t

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu, Q., Li, X. The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice. J. Vis. Exp. (151), e59950, doi:10.3791/59950 (2019).

View Video