La détection de 5-Hydroxymethylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau des souris

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour détecter 5-hydroxymethylcytosine dans les cellules et les tissus cérébraux, utilisant la coloration d’immunofluorescence et les méthodes de point-blot d’ADN.

Abstract

Plusieurs modifications de l’ADN ont été identifiées dans le génome des mammifères. De cela, 5-méthylcytosine et 5-hydroxymethylcytosine-négociés mécanismes épigénétiques ont été intensivement étudiés. 5-hydroxymethylcytosine affiche des caractéristiques dynamiques pendant le développement embryonnaire et postnatal du cerveau, joue une fonction de régulation dans l’expression des gènes, et est impliqué dans de multiples troubles neurologiques. Ici, nous décrivons les méthodes détaillées comprenant la coloration d’immunofluorescence et le point-blot d’ADN pour détecter 5-hydroxymethylcytosine dans les cellules cultivées et les tissus de cerveau de la souris.

Introduction

Les modifications épigénétiques, y compris la modification de l’ADN, la modification de l’histone et la modification de l’ARN, ont été montrées pour jouer des fonctions essentielles dans divers processus biologiques et maladies^{1,2,3, 4 ( en} plus) ^{, 5 Annonces , 6} Annonces ^{, 7}. Pendant longtemps, la méthylation de l’ADN (c.-à-d. 5-méthylcytosine (5-mC)) a été considérée comme un marqueur épigénétique très stable et ne peut pas être modifiée davantage dans le génome. Récemment, il a été constaté que 5-mC pourrait être oxydé à 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) par TET (Ten-eleven translocations) protéines familiales, y compris TET1, TET2, et TET3^8,9. D’autres études montrent que 5-hmC pourrait servir de marqueur stable et jouer des rôles biologiques en régulant l’expression des gènes^4,10,11,12.

Les preuves actuelles indiquent que le 5-hmC est fortement enrichi dans les tissus/cellules neuronaux par rapport à d’autres types de tissus chez les mammifères, et présente des dispositifs dynamiques pendant le développement neuronal^13,14. Dans le système neuronal, les modifications épigénétiques négociées 5-hmC jouent un rôle important dans la régulation des cellules souches neurales, de l’activité neuronale, de l’apprentissage et de la mémoire, et sont impliquées dans de multiples troubles neurologiques, y compris le syndrome de Rett, l’autisme, la maladie d’Alzheimer maladie, la maladie de Huntington, etc.^{2,13,15,16,17,18,19,20}.

Il existe plusieurs approches pour détecter 5-hmC dans les cellules et les tissus^{14,21,22,23,24}. Ici, nous décrivons deux méthodes pour détecter l’existence de 5-hmC et quantifier le niveau global de 5-hmC : coloration d’immunofluorescence et point-blot d’ADN. Ces deux méthodes sont pratiques et sensibles, et ont été utilisées avec succès dans les études précédentes^{25,26,27,28,29,30}. Les étapes clés de ces deux méthodes sont la dénaturation de l’ADN. Pour la coloration d’immunofluorescence de 5-hmC, le pré-traitement des échantillons avec 1 M HCl est exigé. Pour 5-hmC dot-blot, la dénaturation de l’ADN est effectuée avec la solution NaOH. Ces deux méthodes ainsi que le séquençage de la prochaine génération sont des outils très utiles pour étudier la fonction de 5-hmC.

Protocol

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université du Zhejiang. 1. La culture des cellules souches et neurones neuronaux neuronaux adultes Isoler les cellules souches neurales adultes du cerveau d’un adulte (8-10 semaines) souris mâle C57/BL6 tel que décrit précédemment31,32. Culture cellules souches neurales adultes dans le milieu DMEM/F-12 cont…

Representative Results

Pour révéler la distribution de 5-hmC dans l’hippocampe des souris adultes, nous avons exécuté l’immunofluorescence avec des anticorps contre des cellules neuronales (NeuN) et 5-hmC. Dans l’hippocampe, 5-hmC co-localisé bien avec le marqueur cellulaire neuronal NeuN (Figure 1A-H), suggérant un enrichissement de 5-hmC dans les neurones. Pour déterminer la dynamique du 5-hmC pendant le développement neuronal, un point-blot a été réalisé …

Discussion

Les modifications épigénétiques jouent des rôles essentiels pendant le développement, la maturation et la fonction du cerveau. Comme marqueur stable pour la modification d’ADN, le 5-hmC dynamique répond à l’adaptation comportementale, à l’activité neuronale, et est positivement corrélé avec l’expression de gène ; ainsi, il est impliqué dans la fonction normale du cerveau et du désordre neurologique^4. Pour explorer sa fonction dans les cellules et les tissus, il est nécessaire de dé…

Materials

4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )	Sigma-Aldrich	D8417
Adobe Photoshop software	Adobe Inc.	/
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher	A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher	A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine	Active Motif	39769
anti-NeuN	Millipore	MAB377
B27 supplement	Gibco	12587-010
B27 supplement	Gibco	12580-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
Cryostat microtome	Leica	CM1950
DMEM/F-12 medium	OmegaScientific	DM25
epidermal growth factor	PeproTech	100-15
Fibroblast growth factor-basic	PeproTech	100-18B
forskolin	Sigma-Aldrich	F6886
GlutaMax	Thermo	35050061
L-Glutamine	Gibco	25030-149
neurobasal medium	Gibco	21103-049
normal goat serum	Vector Laboratories	Z0325
nylon membrane (Hybond™-N+ )	Amersham Biosciences	RPN303B
OCT	Leica	14020108926
Pen Strep	Gibco	15140-122
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )	Sigma-Aldrich	516726
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899-10
proteinase K	VVR	39450-01-6
retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Triton X-100	Solarbio	T8210