La detección de 5-Hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para detectar 5-hidroximetilcitosina en células y tejidos cerebrales, utilizando la tinción de inmunofluorescencia y métodos de adn-blot.

Abstract

Se han identificado múltiples modificaciones del ADN en el genoma de los mamíferos. De eso, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina-mediada mecanismos epigenéticos se han estudiado intensamente. 5-hidroximetilcitosina muestra características dinámicas durante el desarrollo embrionario y postnatal del cerebro, desempeña una función reguladora en la expresión génica, y participa en múltiples trastornos neurológicos. Aquí, describimos los métodos detallados incluyendo la tinción de inmunofluorescencia y la mancha de puntos de ADN para detectar 5-hidroximetilcitosina en células cultivadas y tejidos cerebrales de ratón.

Introduction

Se ha demostrado que las modificaciones epigenéticas, incluidas la modificación del ADN, la modificación de la histona y la modificación del ARN, desempeñan funciones esenciales en diversos procesos biológicos y enfermedades^{1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7}. Durante mucho tiempo, la metilación del ADN (es decir, 5-metilcitosina (5-mC)) se ha visto como un marcador epigenético altamente estable y no puede modificarse más en el genoma. Recientemente, se ha encontrado que 5-mC podría ser oxidado a 5-hidroximetilcitosina(5-hmC) por TET (diez-once translocaciones) proteínas de la familia incluyendo TET1, TET2, y TET3^8,9. Otros estudios muestran que 5-hmC podría servir como un marcador estable y desempeñar funciones biológicas a través de la regulación de la expresión génica^4,10,11,12.

Las pruebas actuales indican que 5-hmC está altamente enriquecido en tejidos/células neuronales en relación con otros tipos de tejidos en mamíferos, y exhibe características dinámicas durante el desarrollo neuronal^13,14. En el sistema neuronal, las modificaciones epigenéticas mediadas por 5 hmC desempeñan un papel importante en la regulación de las células madre neuronales, la actividad neuronal, el aprendizaje y la memoria, y está implicada en múltiples trastornos neurológicos como el síndrome de Rett, el autismo, la enfermedad de Alzheimer enfermedad, enfermedad de Huntington, etc.^{2,13,15,16,17,18,19,20}.

Existen varios enfoques para detectar 5 hmC en células y tejidos^{14,21,22,23,24}. Aquí, describimos dos métodos para detectar la existencia de 5 hmC y cuantificar el nivel global de 5-hmC: la tinción de inmunofluorescencia y el ADN punto-blot. Estos dos métodos son convenientes y sensibles, y se han utilizado con éxito en estudios anteriores^{25,26,27,28,29,30}. Los pasos clave de estos dos métodos son la desnaturalización del ADN. Para la tinción de inmunofluorescencia de 5 hmC, se requiere el pretratamiento de muestras con 1 M HCl. Para la eliminación de puntos de 5 hmC, la desnaturalización del ADN se realiza con la solución NaOH. Estos dos métodos junto con la secuenciación de próxima generación son herramientas muy útiles para investigar la función de 5 hmC.

Protocol

Todos los procedimientos animales han sido aprobados por el Comité de ética animal de la Universidad de Zhejiang. 1. La cultura de las células madre neuronales adultas y las neuronas Aísle las células madre neurales adultas del antecebrade de un ratón macho adulto (8-10 semanas de edad) C57/BL6 como se describió anteriormente31,32. Cultivo de células madre neurales adultas en medio DMEM/F-12 que contiene 20 …

Representative Results

Para revelar la distribución de 5 hmC en el hipocampo de ratones adultos, realizamos inmunofluorescencia con anticuerpos contra células neuronales (NeuN) y 5-hmC. En el hipocampo, 5-hmC co-localizado bien con marcador de células neuronales NeuN (Figura 1A-H), lo que sugiere un enriquecimiento de 5-hmC en las neuronas. Para determinar la dinámica de 5 hmC durante el desarrollo neuronal, primero se realizó un punto-blot con muestras de ADN aisl…

Discussion

Las modificaciones epigenéticas desempeñan un papel esencial durante el desarrollo cerebral, la maduración y la función. Como marcador estable para la modificación del ADN, la dinámica de 5 hmC responde a la adaptación conductual, la actividad neuronal y está correlacionada positivamente con la expresión génica; por lo tanto, está involucrado en la función normal del cerebro y el trastorno neurológico⁴. Para explorar su función en células y tejidos, es necesario detectar la existenc…

Materials

4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )	Sigma-Aldrich	D8417
Adobe Photoshop software	Adobe Inc.	/
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher	A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher	A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine	Active Motif	39769
anti-NeuN	Millipore	MAB377
B27 supplement	Gibco	12587-010
B27 supplement	Gibco	12580-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
Cryostat microtome	Leica	CM1950
DMEM/F-12 medium	OmegaScientific	DM25
epidermal growth factor	PeproTech	100-15
Fibroblast growth factor-basic	PeproTech	100-18B
forskolin	Sigma-Aldrich	F6886
GlutaMax	Thermo	35050061
L-Glutamine	Gibco	25030-149
neurobasal medium	Gibco	21103-049
normal goat serum	Vector Laboratories	Z0325
nylon membrane (Hybond™-N+ )	Amersham Biosciences	RPN303B
OCT	Leica	14020108926
Pen Strep	Gibco	15140-122
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )	Sigma-Aldrich	516726
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899-10
proteinase K	VVR	39450-01-6
retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Triton X-100	Solarbio	T8210