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Neurowissenschaften

マウスの神経幹細胞と脳における5-ヒドロキシメチルシトシンの検出

Published: September 19, 2019
doi:
10.3791/59950
, , , ,
1The Children’s Hospital, School of Medicine,Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine,Zhejiang University

Summary

ここでは、細胞および脳組織中の5-ヒドロキシメチルシトシンを検出するプロトコルを提示し、免疫蛍光染色およびDNAドットブロット法を利用する。

Abstract

哺乳類ゲノムでは複数のDNA修飾が同定されている。そのうち、5-メチルサイトシンおよび5-ヒドロキシメチルシトシン媒介エピジェネティックメカニズムが集中的に研究されている。5-ヒドロキシメチルシトシンは、脳の胚および出生後の発達中に動的特徴を示し、遺伝子発現の調節機能を果たし、複数の神経障害に関与している。ここでは、マウスの培養細胞および脳組織における5-ヒドロキシメチルシトシンを検出する免疫蛍光染色およびDNAドットブロットを含む詳細な方法について説明する。

Introduction

DNA修飾、ヒストン修飾およびRNA修飾を含むエピジェネティック修飾は、多様な生物学的プロセスおよび疾患1、2、3において重要な機能を果たすることが示されている。4,5,6,7.長い間、DNAメチル化(すなわち、5-メチルサイトシン(5-mC))は、非常に安定なエピジェネティックマーカーと見なされており、ゲノム内で更に改変することはできません。最近では、TET1、TET2、TET38、9を含むTET(11-11転座)ファミリータンパク質により、5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hmC)に5-mCを酸化することができることが分かっています。さらなる研究は、5-hmCが安定したマーカーとして機能し、遺伝子発現4、10、11、12を調節することにより生物学的役割を果たすことができることを示しています。

本示の証拠は、5-hmCが哺乳動物の他のタイプの組織に対して神経組織/細胞において非常に濃縮され、神経発達13、14の間に動的特徴を示すことを示している。神経系では、5hmC媒介エピジェネティック修飾は、神経幹細胞、神経活動、学習および記憶を調節する上で重要な役割を果たし、レット症候群、自閉症、アルツハイマー病を含む複数の神経疾患に関与している。病気、ハンチントン病等 2,13,15,16,17,18,19,20.

細胞および組織の5-hmCを検出するためのいくつかのアプローチがあります14,21,22,23,24.ここでは、5hmCの存在を検出し、5-hmCのグローバルレベルを定量化する2つの方法について述べています:免疫蛍光染色とDNAドットブロット。これらの2つの方法は便利で敏感であり、以前の研究25、26、27、28、29、30で正常に使用されている。これら2つの方法の重要なステップは、DNAの脱彩化です。5-hmCの免疫蛍光染色のためには、1M HClを有する試料の前処理が必要である。5hmCドットブロットの場合、DNAの退化はNaOH溶液で行われます。これらの2つの方法と次世代シーケンシングは、5-hmCの機能を調るための非常に有用なツールです。

Protocol

すべての動物の手順は浙江大学の動物倫理委員会によって承認されています。 1. 成人神経幹細胞とニューロンの培養 成人の前脳から成体神経幹細胞を分離する(8〜10週齢)C57/BL6雄マウスは、前述の31,32である。 20 ng/mL FGF-2を含むDMEM/F-12培地中の成人神経幹細胞、20ng/mL EGF、27サプリメント、1%抗生物質抗マイコテ?…

Representative Results

成体マウスの海馬における5hmCの分布を明らかにするために、神経細胞(NeuN)および5-hmCに対する抗体を用いて免疫蛍光を行った。海馬では、5-hmCがニューロン細胞マーカーNeuN(図1A-H)とうまく共局在し、ニューロン中の5-hmCの濃縮を示唆した。 神経発達中の5hmCのダイナミクスを決定するために、ドットブロットは、増殖および分化した成人…

Discussion

エピジェネティック修飾は、脳の発達、成熟、および機能の間に重要な役割を果たします。DNA修飾の安定したマーカーとして、動的5-hmCは行動適応、神経活性に応答し、遺伝子発現と正の相関関係がある。したがって、脳および神経障害4の正常な機能に関与している。細胞や組織におけるその機能を探索するには、5-hmCの存在を検出し、治療前と治療後のレベルを比較する?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

XLは、中国国家主要研究開発プログラム(2017YFE0196600)と中国国家自然科学財団(助成第31771395号、31571518)によって一部支援されました。Q.S.は、中国国家主要研究開発プログラム(2017YFC1001703)と浙江省の主要研究開発プログラム(2017C03009)の支援を受けました。W.X.は浙江省自然科学財団(LY18H020002)と浙江省科学技術部(2017C37057)の支援を受けた。

Materials

4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
neurobasal medium Gibco 21103-049
normal goat serum Vector Laboratories Z0325
nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
proteinase K VVR 39450-01-6
retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210
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Referenzen

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Keywords: 5-hydroxymethylcytosine5hmCImmunofluorescenceDNA Dot-blotNeural Stem CellsMouse BrainEpigenetic ModificationGene ExpressionNeurological DisordersPerfusionFixationCryosectioningImmunostaining
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Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu, Q., Li, X. The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice. J. Vis. Exp. (151), e59950, doi:10.3791/59950 (2019).
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