A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar 5 hydroxymethylcytosine nas pilhas e nos tecidos do cérebro, utilizando a mancha da imunofluorescência e os métodos do dot-borrão do ADN.
Abstract
As modificações múltiplas do ADN foram identificadas no genoma mamífero. Deste, 5-methylcytosine e 5-hydroxymethylcytosine-mediam mecanismos epigenéticas foram estudados intensivamente. 5-Hidroximetilcitosina apresenta características dinâmicas durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal do cérebro, desempenha uma função reguladora na expressão gênica, e está envolvida em múltiplas desordens neurológicas. Aqui, nós descrevemos os métodos detalhados que incluem a coloração da imunofluorescência e o dot-borrão do ADN para detectar 5 hydroxymethylcytosine em pilhas cultivadas e em tecidos do cérebro do rato.
Introduction
As modificações epigenéticas, incluindo a modificação do ADN, a modificação do histona e a modificação do RNA, foram mostradas para jogar funções essenciais em processos e em doenças biológicos diversos1,2,3, 4. º , 5. º , 6 anos de , 7. por um longo tempo, METILAÇÃO de DNA (ou seja, 5-metilcitosina (5-MC)) tem sido visto como um marcador epigenético altamente estável e não pode ser mais modificado no genoma. Recentemente, verificou-se que 5-MC poderia ser oxidado a 5-Hidroximetilcitosina (5-hmC) por Tet (dez-onze translocações) proteínas dafamília, incluindoTET1, TET2, e TET38,9. Estudos adicionais mostram que 5-hmC poderia servir como um marcador estável e desempenhar papéis biológicos através da regulação da expressão gênica4,10,11,12.
As evidências atuais indicam que 5-hmC é altamente enriquecido em tecidos/células neuronais em relação a outros tipos de tecidos em mamíferos, e apresenta características dinâmicas durante o desenvolvimento neuronal13,14. No sistema neuronal, as modificações epigenéticas mediadas por 5 hmC desempenham um papel importante na regulação das células-tronco neurais, atividade neuronal, aprendizagem e memória, e está envolvida em múltiplas desordens neurológicas, incluindo Síndrome de Rett, autismo, Alzheimer doença de Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Existem várias abordagens para a detecção de 5-hmC em células e tecidos14,21,22,23,24. Aqui, nós descrevemos dois métodos para detectar a existência de 5-hmC e quantificamos o nível global de 5-hmC: a coloração da imunofluorescência e o dot-borrão do ADN. Estes dois métodos são convenientes e sensíveis, e foram usados com sucesso em estudos precedentes25,26,27,28,29,30. Os passos-chave destes dois métodos são a desnaturação do DNA. Para a coloração da imunofluorescência de 5-hmC, o pré-tratamento das amostras com 1 M HCl é exigido. Para o ponto-borrão de 5 hmC, a desnaturação do ADN é executada com solução de NaOH. Esses dois métodos, juntamente com o sequenciamento de próxima geração, são ferramentas muito úteis para investigar a função do 5-hmC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificações epigenéticas desempenham papéis essenciais durante o desenvolvimento do cérebro, maturação e função. Como um marcador estável para a modificação do ADN, o 5-hmC dinâmico responde à adaptação comportamental, à atividade neuronal, e é correlacionado positivamente com a expressão de gene; assim, está envolvida na função normal do cérebro e da desordem neurológica4. Para explorar sua função em células e tecidos, é necessário detectar a existência de 5-hmC e c…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O XL foi apoiado na parte pelo programa nacional da chave R & D de China (2017YFE0196600), e pela Fundação Nacional da ciência natural de China (Grant nos. 31771395, 31571518). VEÍCULO especial Q.S.P. foi apoiado pelo programa de pesquisa e desenvolvimento chave nacional da China (2017YFC1001703) e o programa-chave de pesquisa e desenvolvimento da província de Zhejiang (2017C03009). W.X. foi apoiado pela Fundação de ciência natural da província de Zhejiang (LY18H020002) e departamento de tecnologia da ciência da província de Zhejiang (2017C37057).
Materials
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 |
| epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B |
| forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 |
| neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 |
| nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B |
| OCT | Leica | 14020108926 |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 |
| phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 |
| proteinase K | VVR | 39450-01-6 |
| retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
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