De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van 5-hydroxymethylcytosine in cellen en hersenweefsels, met behulp van immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot-methoden.
Abstract
In het genoom van zoogdieren zijn meerdere DNA-modificaties geïdentificeerd. Van die, 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine-gemedieerde Epigenetische mechanismen zijn intensief bestudeerd. 5-hydroxymethylcytosine toont dynamische kenmerken tijdens de embryonale en postnatale ontwikkeling van de hersenen, speelt een regelgevende functie in genexpressie, en is betrokken bij meerdere neurologische aandoeningen. Hier beschrijven we de gedetailleerde methoden, waaronder immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot om 5-hydroxymethylcytosine in gekweekte cellen en hersenweefsels van de muis te detecteren.
Introduction
Epigenetische modificaties, waaronder DNA modificatie, Histon modificatie en RNA modificatie, is aangetoond dat het spelen van essentiële functies in diverse biologische processen en ziekten1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. voor een lange tijd, DNA-methylatie (dat wil zeggen, 5-methylcytosine (5-mC)) is gezien als een zeer stabiele epigenetische marker en kan niet verder worden gewijzigd in het genoom. Onlangs, het is gebleken dat 5-mC kan worden geoxideerd tot 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) door TET (ten-elf translocaties) familie-eiwitten, met inbegrip van TET1, TET2, en TET38,9. Verdere studies tonen aan dat 5-HMC kan dienen als een stabiele marker en spelen biologische rollen door het reguleren van genexpressie4,10,11,12.
De huidige bewijzen geven aan dat 5-HMC sterk is verrijkt in neuronale weefsels/cellen ten opzichte van andere soorten weefsels in zoogdieren, en vertoont dynamische kenmerken tijdens neuronale ontwikkeling13,14. In het neuronale systeem, 5-hmC gemedieerde epigenetische modificaties spelen een belangrijke rol bij het reguleren van neurale stamcellen, neuronale activiteit, leren en geheugen, en is betrokken bij meerdere neurologische aandoeningen met inbegrip van Rett syndroom, autisme, Alzheimer ziekte, de ziekte van Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Er zijn verschillende benaderingen voor het opsporen van 5-HMC in cellen en weefsels14,21,22,23,24. Hier beschrijven we twee methoden om het bestaan van 5-hmC te detecteren en het wereldwijde niveau van 5-hmC te kwantificeren: immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot. Deze twee methoden zijn handig en gevoelig, en zijn met succes gebruikt in eerdere studies25,26,27,28,29,30. De belangrijkste stappen van deze twee methoden zijn DNA-denaturatie. Voor immunofluorescentie kleuring van 5-hmC is pre-behandeling van monsters met 1 M HCl vereist. Voor 5-hmC dot-Blot wordt DNA-denaturatie uitgevoerd met NaOH-oplossing. Deze twee methoden samen met de volgende generatie sequencing zijn zeer nuttig hulpmiddelen voor het onderzoeken van de functie van 5-hmC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenetische modificaties spelen essentiële rollen tijdens de ontwikkeling van de hersenen, rijping, en functie. Als een stabiele marker voor DNA-modificatie, reageert Dynamic 5-hmC op gedrags aanpassing, neuronale activiteit, en is positief gecorreleerd met genexpressie; Dus, het is betrokken bij de normale functie van de hersenen en neurologische aandoening4. Om zijn functie in cellen en weefsels te verkennen, is het noodzakelijk om het bestaan van 5-hmC te detecteren en het niveau voor en na …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XL werd deels gesteund door de nationale sleutel R & D-programma van China (2017YFE0196600), en de National Natural Science Foundation of China (Grant NOS. 31771395, 31571518). Q.S. werd gesteund door de National Key Research and Development Program van China (2017YFC1001703) en de belangrijkste onderzoeks-en ontwikkelingsprogramma van de provincie Zhejiang (2017C03009). W.X. werd gesteund door de Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY18H020002) en Science Technology Department van de provincie Zhejiang (2017C37057).
Materials
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 |
| epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B |
| forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 |
| neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 |
| nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B |
| OCT | Leica | 14020108926 |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 |
| phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 |
| proteinase K | VVR | 39450-01-6 |
| retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
Referenzen
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
- Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
- Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
- Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
- Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
- Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , 245-254 (2003).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer’s disease. BMC Genomics. 17, (2016).
- Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
- Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer’s disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
- Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
- Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
- Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
- Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
- Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
- Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
- Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
- Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
- Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
