여기에서, 우리는 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩 방법을 활용하여 세포와 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다.
포유류 게놈에서 여러 DNA 변형이 확인되었다. 그 중, 5-메틸시토신 및 5-하이드록시메틸시토신 매개 후생유전학 적 메커니즘이 집중적으로 연구되었습니다. 5-하이드록시메틸시토신은 뇌의 배아 및 산후 발달 시 동적 특징을 표시하고 유전자 발현에서 조절 기능을 하며 여러 신경 장애에 관여합니다. 여기서, 우리는 마우스의 배양 된 세포 및 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸 사이토신을 검출하기 위해 면역 형광 염색 및 DNA 도트 블롯을 포함한 상세한 방법을 설명합니다.
DNA 변형, 히스톤 변형 및 RNA 변형을 포함한 후생 유전학적 변형은 다양한 생물학적 과정과 질병1,2,3에서필수적인 기능을 하는 것으로 나타났습니다. 4개 , 5개 , 6개 , 7.오랜 시간 동안, DNA 메틸화(즉, 5-메틸시토신(5-mC))는 매우 안정적인 후성유전학 적 마커로서 간주되어 왔으며 게놈에서 더 이상 변형될 수 없다. 최근, 5-mC는 TET1, TET2 및 TET38,9를포함하는 TET(11-11전좌) 패밀리 단백질에 의해 5-하이드록시메틸시토신(5-hmC)으로 산화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 추가 연구는 5-hmC가 안정한 마커로 작용할 수 있고 유전자 발현조절을통해 생물학적 역할을 할 수 있음을 보여준다4,10,11,12.
본 증거는 5-hmC가 포유동물의 다른 유형의 조직에 비해 신경 조직/세포에서 고도로 농축되고, 신경 발달13,14동안 동적 특징을 나타낸다는 것을 나타낸다. 신경 시스템에서, 5-hmC 중재 후생 유전학 수정 신경 줄기 세포를 조절에 중요 한 역할을, 신경 활동, 학습 및 메모리, Rett 증후군을 포함 하 여 여러 신경 질환에 관여, 자폐증, 알 츠 하이 머 병 질병, 헌팅턴병 등2,13,15,16,17,18,19,20.
세포 및 조직14,21,22,23,24에서5-hmC를 검출하기위한 몇 가지 접근법이 있습니다. 여기에서, 우리는 5-hmC의 존재를 검출하고 5-hmC의 글로벌 수준을 정량화하는 2개의 방법을 기술합니다: 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩. 이 두 가지 방법은 편리하고 민감하며 이전 연구25,26,27,28,29,30에서성공적으로 사용되었습니다. 이 두 방법의 주요 단계는 DNA 변성입니다. 5-hmC의 면역 형광 염색을 위해 1 M HCl로 시료를 전처리해야합니다. 5-hmC 도트 블롯의 경우 NAOH 용액으로 DNA 변이가 수행됩니다. 이 두 가지 방법은 차세대 시퀀싱과 함께 5-hmC의 기능을 조사하는 데 매우 유용한 도구입니다.
후성 유전학 수정은 뇌 발달, 성숙 및 기능 중에 필수적인 역할을합니다. DNA 변형을 위한 안정한 마커로서, 동적 5-hmC는 행동 적응, 신경 활성에 반응하고, 유전자 발현과 긍정적으로 상관관계가 있다; 따라서, 뇌 및 신경 장애의 정상적인 기능에 관여4. 세포와 조직에서 의 기능을 탐구하려면 5-hmC의 존재를 감지하고 치료 전후의 수준을 비교해야합니다. 여기에서, 우리는 실험실?…
The authors have nothing to disclose.
XL은 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFE0196600)과 중국 국립자연과학재단(Grant Nos. 31771395, 31571518)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. Q.S.는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2017YFC1001703)과 절강성의 주요 연구 개발 프로그램(2017C03009)의 지원을 받았습니다. W.X.는 절강성 자연과학 재단(LY18H020002)과 절강성 과학기술부(2017C37057)의 지원을 받았습니다.
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 |
Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 |
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 |
anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 |
anti-NeuN | Millipore | MAB377 |
B27 supplement | Gibco | 12587-010 |
B27 supplement | Gibco | 12580-010 |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 |
Cryostat microtome | Leica | CM1950 |
DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 |
epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 |
Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B |
forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 |
GlutaMax | Thermo | 35050061 |
L-Glutamine | Gibco | 25030-149 |
neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 |
nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B |
OCT | Leica | 14020108926 |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 |
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 |
Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 |
proteinase K | VVR | 39450-01-6 |
retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
Triton X-100 | Solarbio | T8210 |