التصوير الفلوري متعدد الخلية أحادي الخلية لتصور الأحماض النووية الفيروسية والبروتينات ومراقبة فيروس نقص المناعة البشرية و HTLV و HBV و HCV وفيروس زيكا وعدوى الأنفلونزا
Summary
يظهر هنا بروتوكول لنهج التصوير الفلوري ، multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA ، RNA ، و protein (MICDDRP) ، وهي طريقة قادرة على التصور المتزامن لخلية واحدة من البروتين الفيروسي والأحماض النووية من أنواع مختلفة وتقطعت بهم السبل. يمكن تطبيق هذا النهج على مجموعة متنوعة من الأنظمة.
Abstract
وقد أعيق التقاط عمليات النسخ المتماثل والتجميع الديناميكيين للفيروسات بسبب الافتقار إلى تقنيات التهجين في الموقع (ISH) القوية التي تمكن من وضع العلامات الحساسة والمتزامنة للحمض النووي الفيروسي والبروتين. غالبا ما تكون طرق التهجين الموضعي التقليدية للحمض النووي (FISH) غير متوافقة مع التلوين المناعي. لذلك قمنا بتطوير نهج التصوير ، MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA ، RNA و protein) ، والذي يتيح التصور المتزامن لخلية واحدة للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين. بالمقارنة مع أسماك الحمض النووي التقليدية ، يستخدم MICDDRP تقنية الحمض النووي المتفرع (bDNA) ISH ، والتي تعمل على تحسين حساسية مسبار قليل النوكليوتيد واكتشافه بشكل كبير. تتيح التعديلات الصغيرة ل MICDDRP تصوير البروتينات الفيروسية بالتزامن مع الأحماض النووية (RNA أو DNA) ذات الخيوط المختلفة. لقد طبقنا هذه البروتوكولات لدراسة دورات حياة مسببات الأمراض الفيروسية المتعددة ، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -1 ، وفيروس T-lymphotropic البشري (HTLV) -1 ، وفيروس التهاب الكبد B (HBV) ، وفيروس التهاب الكبد C (HCV) ، وفيروس زيكا (ZKV) ، وفيروس الأنفلونزا A (IAV). لقد أثبتنا أنه يمكننا تسمية الأحماض النووية الفيروسية والبروتينات بكفاءة عبر مجموعة متنوعة من الفيروسات. يمكن أن تزودنا هذه الدراسات بفهم ميكانيكي محسن للأنظمة الفيروسية المتعددة ، بالإضافة إلى ذلك ، تعمل كقالب لتطبيق التصوير الفلوري المتعدد للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين عبر مجموعة واسعة من الأنظمة الخلوية.
Introduction
في حين أن الآلاف من الأجسام المضادة التجارية متاحة لتسمية البروتينات على وجه التحديد من خلال مناهج التلوين المناعي التقليدية ، وبينما يمكن هندسة بروتينات الاندماج باستخدام علامات الفلورسنت المحسنة للصور لتتبع بروتينات متعددة في العينة1 ، فإن التصور المجهري للبروتين غالبا ما يكون غير متوافق مع التهجين التقليدي للحمض النووي في الموقع (FISH)2 . أعاقت القيود التقنية في التصور المتزامن للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام الأساليب القائمة على التألق الفهم المتعمق لتكاثر الفيروس. يسمح تتبع كل من الحمض النووي الفيروسي والبروتين أثناء العدوى لعلماء الفيروسات بتصور العمليات الأساسية التي تكمن وراء تكاثر الفيروس وتجميعه3،4،5،6.
لقد طورنا نهجا للتصوير ، multiplex immunofluorescent cell القائم على d etection ل DNA ، RNA ، و Protein (MICDDRP) 3 ، والذي يستخدم تقنية الحمض النووي المتفرع (bDNA) في الموقع لتحسين حساسية الكشف عن الحمض النووي7،8،9 . بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم هذه الطريقة مجسات مقترنة لتحسين الخصوصية. تستخدم المجسات الخاصة بتسلسل bDNA الحمض النووي المضخم المتفرع والحمض النووي المضخم لإنتاج إشارة مكثفة وموضعية ، مما يحسن طرق التهجين السابقة التي اعتمدت على استهداف المناطق المتكررة في الحمض النووي9. غالبا ما لا تحتوي الخلايا المصابة في سياق سريري على مواد وراثية فيروسية وفيرة ، مما يوفر سلعة لطريقة حساسة للكشف عن الحمض النووي الفلوري في إعدادات التشخيص. وقد ملأ تسويق تكنولوجيا bDNA من خلال نهج مثل RNAscope7 و ViewRNA10 هذا المكانة. كما أن حساسية التصوير الفلوري bDNA لها فائدة مهمة في بيولوجيا الخلية ، مما يسمح باكتشاف أنواع الحمض النووي النادرة في نماذج زراعة الخلايا. التحسن الكبير في الحساسية يجعل طرق التصوير القائمة على الحمض النووي البريطاني مناسبة لدراسة الفيروسات. ومع ذلك ، فإن العيب المحتمل هو أن هذه الطرق تركز على تصور الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي والبروتين. تحتوي جميع الخلايا المتكاثرة والعديد من الفيروسات على جينومات الحمض النووي أو تشكل الحمض النووي أثناء دورة النسخ المتماثل ، مما يجعل الطرق القادرة على تصوير كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، وكذلك البروتين ، مرغوبة للغاية.
في بروتوكول MICDDRP ، نقوم بإجراء bDNA FISH للكشف عن الحمض النووي الفيروسي باستخدام طريقة RNAscope ، مع التعديلات7. أحد التعديلات الرئيسية على هذا البروتوكول هو تحسين علاج الأنزيم البروتيني بعد التثبيت الكيميائي. يسهل العلاج بالبروتياز إزالة البروتينات المرتبطة بالحمض النووي لتحسين كفاءة تهجين المسبار. يتبع العلاج بالبروتياز حضانة بمسبار (مسبار) قليل النوكليوتيد المتفرع. بعد تطبيق مسبار (مسبار) bDNA ، يتم غسل العينات وتحضينها لاحقا باستخدام الحمض النووي للإشارة المسبقة ومكبر الصوت. يتطلب التهجين المتعدد في الموقع (ISH) ، ووضع العلامات على أهداف جينية متعددة ، مجسات مستهدفة بقنوات ألوان مختلفة للتمايز الطيفي7. يتبع الحضانة مع مكبرات الحمض النووي التألق المناعي (IF).
يضفي bDNA ISH تحسينات في الإشارة إلى الضوضاء عن طريق تضخيم الإشارات الخاصة بالهدف ، مع تقليل ضوضاء الخلفية من أحداث التهجين غير المحددة 7,11. تم تصميم المجسات المستهدفة باستخدام برامج متاحة للجمهور تتنبأ باحتمال أحداث التهجين غير المحددة ، بالإضافة إلى حساب درجة حرارة الانصهار (Tm) للهجين المستهدفللمسبار 7,11. تحتوي المجسات المستهدفة على منطقة من 18 إلى 25 قاعدة مكملة لتسلسل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المستهدف ، وتسلسل فاصل ، وتسلسل ذيل مكون من 14 قاعدة. زوج من المجسات المستهدفة ، لكل منها تسلسل ذيل مميز ، يهجن إلى منطقة مستهدفة (تمتد ~ 50 قاعدة). يشكل تسلسلا الذيل موقع تهجين لمجسات ما قبل مكبر الصوت ، والتي تحتوي على 20 موقعا ملزما لمجسات مكبر الصوت ، والتي تحتوي بالإضافة إلى ذلك على 20 موقعا ملزما لمسبار الملصق. على سبيل المثال ، يتم استهداف منطقة كيلو قاعدة واحدة (kb) على جزيء الحمض النووي بواسطة 20 زوجا من المسبار ، مما يؤدي إلى إنشاء سقالة جزيئية للتهجين المتسلسل باستخدام المضخم الأولي ومكبر الصوت ومسبار الملصق. وبالتالي يمكن أن يؤدي ذلك إلى عائد نظري يبلغ 8000 ملصق فلورسنت لكل جزيء حمض نووي ، مما يتيح الكشف عن الجزيئات المفردة والتحسينات الكبيرة على نهج FISH التقليدي7 (انظر الشكل 1A للحصول على مخطط لتضخيم إشارة bDNA). لإعداد مجسات ل ISH المتعدد ، يجب أن يكون كل مسبار مستهدف في قناة لونية مختلفة (C1 أو C2 أو C3). تمتلك هذه المجسات المستهدفة ذات القنوات الملونة المختلفة تسلسلات ذيل مميزة من 14 قاعدة. ستربط تسلسلات الذيل هذه مضخمات إشارة مميزة بمجسات فلورية مختلفة ، مما يتيح التمايز الطيفي السهل عبر أهداف متعددة. في البروتوكول المقدم ، يقدم الجدول 4 في الخطوة 9 مزيدا من المعلومات حول وضع العلامات الفلورية على المجسات المستهدفة. بالإضافة إلى ذلك ، يقدم الشكل 2 والشكل 3 أمثلة على كيفية اختيارنا لمكبر الصوت المناسب 4-FL (A أو B أو C) (مسبار الفلورسنت وخطوة التهجين النهائية) لتحقيق وضع علامات فلورية محددة لأهداف الحمض النووي الفيروسي المتعددة بعد عدوى HIV-1 و HTLV-1.
لقد أظهرنا العديد من التطبيقات لتصور التألق المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتينات ، مع ملاحظة المراحل الحرجة من تكاثر الفيروس بدقة زمانية مكانية عالية3،4،5. على سبيل المثال ، سمح لنا التصور المتزامن لخلية واحدة للحمض النووي الريبي الفيروسي والحمض النووي السيتوبلازمي والنووي والبروتين بتصور الأحداث الرئيسية أثناء الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، بما في ذلك اتباع نوى تحتوي على الحمض النووي الريبي في السيتوبلازم قبل الدخول النووي وتكامل الحمض النوويالفيروسي 3. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطبيق MICDDRP لتوصيف آثار العوامل المضيفة والعلاج بالعقاقير على العدوى الفيروسية والتكرار 4,5. في Ukah et al. ، تتبعنا إعادة تنشيط نسخ HIV-1 في نماذج خلايا الكمون المعالجة بعوامل عكس زمن الوصول المختلفة لتصور نسخ فيروس نقص المناعة البشرية وعكس الكمون4. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسمح لنا MICDDRP بتصور التغيرات المظهرية المرتبطة بالتثبيط المضاد للفيروسات المنسوب إلى العلاج بالجزيئات الصغيرة أو تقييد عامل المضيف. كدليل على المفهوم على متانة نهجنا وقابليته للتطبيق على نطاق واسع ، أثبتنا أنه يمكننا استخدام تعديلات بروتوكولنا لتسمية الحمض النووي الفيروسي بكفاءة لمتابعة العدوى ليس فقط في فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -1 ، ولكن أيضا فيروس T-lymphotropic البشري (HTLV) -1 ، فيروس التهاب الكبد B (HBV) ، فيروس التهاب الكبد C (HCV) ، فيروس زيكا (ZIKV) وفيروس الأنفلونزا A (IAV). نظرا لأن دورة حياة HIV-1 تتكون من كل من أنواع الحمض النووي الفيروسي والحمض النووي الريبي ، فقد أجرينا غالبية تحسيننا ل MICDDRP بعد حركية تكرار HIV-1. ومع ذلك ، بالإضافة إلى ذلك ، فقد أثبتنا أنه يمكننا تتبع تخليق نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسية المختلفة لأي من أو كليهما من الحس (+) و antisense (-) في الفيروسات مثل ZIKV و IAV و HBV و HCV لمراقبة النسخ الفيروسي والنسخ المتماثل3،4،5،6. تهدف الدراسات إلى تحسين الفهم الميكانيكي للعديد من العمليات الفيروسية وتكون بمثابة مبدأ توجيهي لتنفيذ تقنية التصوير الفلوري هذه لمجموعة واسعة من النماذج الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
غالبا ما يتطلب التصور المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين تحسينا واسع النطاق. طريقتان شائعتان هما وضع العلامات 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) و DNA FISH. تم تطبيق وسم EdU لتصور الحمض النووي الفيروسي والبروتين في وقت واحد ، حيث تم دمج EdU في الحمض النووي الناشئ وتم تصنيفه لاحقا بأصباغ فلورية ت…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل كليا أو جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI121315 و R01 AI146017 و R01 AI148382 و R01 AI120860 و R37 AI076119 و U54 AI150472). نشكر الدكتور ريموند ف. شينازي وسادي أميشاي على توفير الخلايا المصابة بفيروس الأنفلونزا أ.
Materials
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
Referenzen
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
