Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Summary

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

Abstract

A captura dos processos dinâmicos de replicação e montagem de vírus tem sido dificultada pela falta de tecnologias robustas de hibridização in situ (ISH) que permitam a marcação sensível e simultânea de ácidos nucleicos virais e proteínas. Os métodos convencionais de hibridização in situ por fluorescência de DNA (FISH) muitas vezes não são compatíveis com a imunocoloração. Portanto, desenvolvemos uma abordagem de imagem, MICDDRP (multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA e proteína), que permite a visualização simultânea de uma única célula de DNA, RNA e proteína. Em comparação com o DNA FISH CONVENCIONAL, O MICDDRP utiliza a tecnologia ISH de DNA ramificado (bDNA), que melhora drasticamente a sensibilidade e a detecção da sonda de oligonucleotídeos. Pequenas modificações do MICDDRP permitem a obtenção de imagens de proteínas virais concomitantemente com ácidos nucleicos (RNA ou DNA) de diferentes filamentosidades. Aplicamos esses protocolos para estudar os ciclos de vida de múltiplos patógenos virais, incluindo o vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1, o vírus linfotrópico T humano (HTLV)-1, o vírus da hepatite B (HBV), o vírus da hepatite C (HCV), o vírus Zika (ZKV) e o vírus influenza A (IAV). Demonstramos que podemos rotular eficientemente ácidos nucleicos virais e proteínas em uma gama diversificada de vírus. Esses estudos podem nos fornecer uma melhor compreensão mecanicista de múltiplos sistemas virais e, além disso, servir como um modelo para a aplicação de imagens de fluorescência multiplexada de DNA, RNA e proteína em um amplo espectro de sistemas celulares.

Introduction

Embora milhares de anticorpos comerciais estejam disponíveis para marcar especificamente proteínas por meio de abordagens convencionais de imunocoloração, e enquanto as proteínas de fusão possam ser projetadas com tags fluorescentes foto-otimizadas para rastrear múltiplas proteínas em uma amostra¹, a visualização microscópica da proteína muitas vezes não é compatível com a hibridização in situ convencional por fluorescência de DNA (FISH)² . Limitações técnicas na visualização simultânea de DNA, RNA e proteína usando abordagens baseadas em fluorescência têm dificultado a compreensão aprofundada da replicação do vírus. O rastreamento do ácido nucleico viral e da proteína durante o curso da infecção permite que os virologistas visualizem processos fundamentais que fundamentam a replicação e a montagem do vírus 3,4,5,6.

Desenvolvemos uma abordagem de imagem, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and Protein (MICDDRP)³, que utiliza tecnologia in situ de DNA ramificado (bDNA) para melhorar a sensibilidade da detecção de ácido nucleico 7,8,9 . Além disso, esse método utiliza sondas emparelhadas para maior especificidade. As sondas específicas da sequência bDNA usam DNAs pré-amplificadores e amplificadores ramificados para produzir um sinal intenso e localizado, melhorando os métodos de hibridização anteriores que dependiam da segmentação de regiões repetidas no DNA⁹. As células infectadas em um contexto clínico muitas vezes não contêm material genético viral abundante, fornecendo uma mercadoria para um método sensível para a detecção de ácido nucleico fluorescente em ambientes de diagnóstico. A comercialização da tecnologia bDNA por meio de abordagens como o RNAscope⁷ e o ViewRNA¹⁰ preencheram esse nicho. A sensibilidade da imagem de fluorescência de bDNA também tem importante utilidade na biologia celular, permitindo a detecção de espécies escassas de ácidos nucleicos em modelos de cultura celular. A grande melhoria da sensibilidade torna os métodos de imagem baseados em bDNA adequados para o estudo de vírus. Uma deficiência potencial, no entanto, é que esses métodos se concentram na visualização de RNA ou RNA e proteína. Todas as células replicantes e muitos vírus têm genomas de DNA ou formam DNA durante seu ciclo de replicação, tornando os métodos capazes de visualizar tanto o RNA quanto o DNA, bem como proteínas, altamente desejáveis.

No protocolo MICDDRP, realizamos o bDNA FISH para detecção de ácido nucleico viral pelo método RNAscope, com modificações⁷. Uma das principais modificações deste protocolo é a otimização do tratamento com protease após a fixação química. O tratamento com protease facilita a remoção de proteínas ligadas ao ácido nucleico para melhorar a eficiência da hibridização da sonda. O tratamento com protease é seguido de incubação com sonda(s) de oligonucleotídeos ramificados. Após a aplicação da(s) sonda(s) de bDNA, as amostras são lavadas e subsequentemente incubadas com DNAs pré-amplificadores e amplificadores de sinal. A hibridização in situ multiplexada (ISH), marcação de múltiplos alvos gênicos, requer sondas alvo com diferentes canais de cor para diferenciação espectral⁷. A incubação com amplificadores de DNA é seguida por imunofluorescência (FI).

O bDNA ISH proporciona melhorias no sinal-ruído pela amplificação de sinais específicos do alvo, com redução do ruído de fundo a partir de eventos de hibridização não específicos ^7,11. As sondas alvo são projetadas usando programas de software disponíveis publicamente que predizem a probabilidade de eventos de hibridização não específicos, bem como calculam a temperatura de fusão (T_m) do híbrido sonda-alvo ^7,11. As sondas alvo contêm uma região de 18 a 25 bases complementar à sequência de DNA/RNA alvo, uma sequência espaçadora e uma sequência de cauda de 14 bases. Um par de sondas de destino, cada uma com uma sequência de cauda distinta, hibridizam para uma região de destino (abrangendo ~ 50 bases). As duas sequências de cauda formam um local de hibridização para as sondas pré-amplificadoras, que contêm 20 locais de ligação para as sondas amplificadoras, que, além disso, contêm 20 locais de ligação para a sonda de etiqueta. Como exemplo, uma região de uma quilobase (kb) na molécula de ácido nucleico é alvo de 20 pares de sondas, criando um andaime molecular para hibridização sequencial com o pré-amplificador, amplificador e sonda de rótulo. Isso pode, portanto, levar a um rendimento teórico de 8000 rótulos fluorescentes por molécula de ácido nucleico, permitindo a detecção de moléculas individuais e grandes melhorias em relação às abordagens convencionais do FISH⁷ (Veja a Figura 1A para o esquema da amplificação do sinal de bDNA). Para configurar testes para ISH multiplexado, cada teste de destino deve estar em um canal de cor diferente (C1, C2 ou C3). Essas sondas alvo com diferentes canais de cores possuem sequências de cauda distintas de 14 bases. Essas sequências de cauda ligarão amplificadores de sinal distintos com diferentes sondas fluorescentes, permitindo assim uma diferenciação espectral fácil em vários alvos. No Protocolo apresentado, a Tabela 4 da Etapa 9, fornece mais informações sobre as sondas alvo de marcação fluorescente. Além disso, a Figura 2 e a Figura 3 fornecem exemplos de como escolhemos o amplificador 4-FL (A, B ou C) apropriado (sonda fluorescente e a etapa final de hibridização) para alcançar a marcação fluorescente específica de múltiplos alvos de ácidos nucleicos virais após infecções por HIV-1 e HTLV-1.

Temos demonstrado diversas aplicações de visualização simultânea por fluorescência de RNA, DNA e proteínas, observando estágios críticos de replicação do vírus com alta resolução espaço-temporal ^3,4,5. Por exemplo, a visualização simultânea de uma única célula do RNA viral, do DNA citoplasmático e nuclear e da proteína nos permitiu visualizar os principais eventos durante a infecção pelo HIV-1, incluindo o acompanhamento de núcleos contendo RNA no citoplasma antes da entrada nuclear e da integração do DNA proviral³. Além disso, aplicamos a MICDDRP para caracterizar os efeitos dos fatores do hospedeiro e do tratamento medicamentoso na infecção e replicação viral ^4,5. Em Ukah et al., rastreamos a reativação da transcrição do HIV-1 em modelos de células de latência tratados com diferentes agentes de reversão de latência para visualizar a transcrição e a reversão de latência do HIV⁴. Além disso, o MICDDRP pode nos permitir visualizar alterações fenotípicas associadas à inibição antiviral atribuída ao tratamento de pequenas moléculas ou à restrição do fator hospedeiro. Como prova de conceito da robustez e ampla aplicabilidade de nossa abordagem, demonstramos que podemos usar modificações de nosso protocolo para rotular eficientemente o ácido nucleico viral para acompanhar a infecção não apenas no vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1, mas também no vírus linfotrópico T humano (HTLV)-1, vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), Zika vírus (ZIKV) e vírus influenza A (IAV). Como o ciclo de vida do HIV-1 consiste em espécies de DNA viral e RNA, realizamos a maior parte de nossa otimização do MICDDRP após a cinética de replicação do HIV-1. No entanto, além disso, demonstramos que podemos rastrear a síntese de diferentes transcritos de RNA viral de uma ou ambas as cadeias de sentido (+) e antisense (-) em vírus como ZIKV, IAV, HBV e HCV para monitorar a transcrição e replicação viral 3,4,5,6. Os estudos visam melhorar a compreensão mecanicista de vários processos virais e servir como uma diretriz para implementar essa tecnologia de imagem de fluorescência para uma ampla gama de modelos celulares.

Protocol

1. Células de sementes (Suspensão vs. Células Aderentes) em lâminas de cobertura ou de câmara (protocolo apresentado utiliza lâminas de cobertura). Semeadura de células de suspensãoPrepare as coberturas revestidas com poli-D-lisina (PDL) (facilita a aderência das células de suspensão à tampa) incubando primeiro as folhas de cobertura em etanol (EtOH) por 5 minutos (esteriliza as folhas de cobertura e remove qualquer resíduo). Em seguida, lave 2x em solução salina tamponada com fo…

Representative Results

Um esquema de MICDDRP é representado na Figura 1. A marcação do DNA e do RNA é seguida por imunocoloração. O uso de amplificadores ramificados aumenta o sinal, permitindo a detecção de moléculas únicas de ácido nucleico. Figura 1: Esquema do MICDDRP e fluxo de trabalho passo a passo. (A) O sinal de bDNA é am…

Discussion

A visualização simultânea de RNA, DNA e proteína geralmente requer otimização extensiva. Dois métodos comumente usados são a marcação de 5-etil-2-desoxiuridina (EdU) e DNA FISH. A marcação EdU tem sido aplicada para visualizar o DNA viral e a proteína simultaneamente, já que a EdU é incorporada no DNA nascente e, posteriormente, marcada com corantes fluorescentes contendo azida por meio da química click. A marcação EdU pode, portanto, ser usada para monitorar a cinética de replicação de vír…

Materials

4% PFA
50% dextran sulfate	Amreso	198	For DNA hybridization buffer
50X wash buffer	ACD Bio	320058
6-well plates
Amplifier 1-FL	ACD Bio
Amplifier 2-FL	ACD Bio
Amplifier 3-FL	ACD Bio
Amplifier 4-FL	ACD Bio		Consult Amp-4 table in protocol
Anti-HCV NS5a antibody	Abcam	ab13833	Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4
Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10 antibody	Abcam	ab80613	Rabbit polyclonal
Anti-PB1 antibody	GeneTex	GTX125923	Antibody against flu protein
Bovine serum albumin			Blocking reagent for immunostaining
Cell media with supplements			Media appropriate for cell model
Coverslips
DAPI	ACD Bio		Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)
Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS)	Gibco	14190250	No calcium and magnesium
Ethylene carbonate	Sigma	E26258
Fetal bovine serum (FBS)			Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)
Fisherbrand colorfrost plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Precleaned
HCV-GT2a-sense-C2 probe	ACD Bio	441371	HCV(+) sense RNA probe
HIV-gagpol-C1	ACD Bio	317701	HIV-1 cDNA probe
HIV-nongagpol-C3	ACD Bio	317711-C	HIV-1 RNA probe
HybEZ hybridization oven	ACD Bio	321710/321720
ImmEdge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Nail polish			For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment
Nuclease free water	Ambion	AM9937
Poly-d-lysine (PDL)			Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes
Probe diluent	ACD Bio	300041	For diluting RNA C2 or C3 probes
Prolong gold antifade	Invitrogen	P36930
Protease III	ACD Bio	322337
RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221
RNase A	Qiagen
Secondary antibodies
Slides
Sodium chloride			For DNA hybridization buffer
Sodium citrate, pH 6.2			For DNA hybridization buffer
Tween-20			For DNA hybridization buffer and PBS-T
V-HBV-GTD	ACD Bio	441351	Total HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2	ACD Bio	465531-C2	HBV pgRNA probe
V-HCV-GT2a probe	ACD Bio	441361	HCV(-) sense RNA probe
V-HTLV-HBZ-sense-C3	ACD Bio	495071-C3	HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ
V-HTLV1-GAG-C2	ACD Bio	495051-C2	HTLV-1 DNA probe
V-HTLV1-GAG-POL-sense	ACD Bio	495061	HTLV-1 (+) sense RNA probe
V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221	IAV RNA probe
V-ZIKA-pp-O2	ACD Bio	464531	Zika(+) sense RNA probe
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2	ACD Bio	478731-C2	Zika(-) sense RNA probe