ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング
Summary
ここで紹介するのは、蛍光イメージングアプローチのためのプロトコルであり、DNA、RNA、およびpロテイン(MICDDRP)の究極の蛍光immuno蛍光c ellベースのデテクションであり、異なるタイプおよび鎖数のウイルスタンパク質および核酸の同時蛍光単一細胞可視化を可能にする方法である。このアプローチは、さまざまなシステムに適用できます。
Abstract
ウイルスの動的な複製および組み立てプロセスのキャプチャは、ウイルスの核酸とタンパク質の高感度かつ同時標識を可能にする堅牢なin situハイブリダイゼーション(ISH)技術の欠如によって妨げられてきました。従来のDNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法は、多くの場合、免疫染色に適合しません。そこで、DNA、RNA、タンパク質のシングルセル同時可視化を可能にするイメージングアプローチMICDDRP(DNA、R NA、PROTEINの究極の蛍光cELベースのデテクション)を開発しました。従来のDNA FISHと比較して、MICDDRPは分岐DNA(bDNA)ISH技術を利用しており、オリゴヌクレオチドプローブの感度と検出を劇的に向上させます。MICDDRPの小さな修飾により、異なる鎖の核酸(RNAまたはDNA)と同時にウイルスタンパク質のイメージングが可能になります。これらのプロトコルを適用して、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)-1、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)-1、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ジカウイルス(ZKV)、インフルエンザAウイルス(IAV)など、複数のウイルス病原体のライフサイクルを研究しています。私たちは、さまざまなウイルスのウイルス核酸とタンパク質を効率的に標識できることを実証しました。これらの研究は、複数のウイルスシステムの機構的理解を向上させることができ、さらに、幅広い細胞系にわたるDNA、RNA、およびタンパク質のマルチプレックス蛍光イメージングのアプリケーションのためのテンプレートとして役立ちます。
Introduction
従来の免疫染色法でタンパク質を特異的に標識するために何千もの市販抗体が利用可能であり、融合タンパク質はサンプル中の複数のタンパク質を追跡するために光最適化蛍光タグで操作できますが1、タンパク質の顕微鏡的可視化は、従来のDNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)2と互換性がないことがよくあります。.蛍光ベースのアプローチを使用したDNA、RNA、およびタンパク質の同時視覚化の技術的限界は、ウイルス複製の深い理解を妨げてきました。感染の過程でウイルス核酸とタンパク質の両方を追跡することで、ウイルス学者はウイルスの複製と組み立ての根底にある基本的なプロセスを視覚化することができます3,4,5,6。
我々は、D NA、RNA、およびPロテイン(MICDDRP)3の究極の蛍光イメージングアプローチを開発し、分岐DNA(bDNA)をin situ技術を利用して核酸検出の感度を向上させました7,8,9。.さらに、この方法では、特異性を高めるためにペアプローブを利用します。bDNA配列特異的プローブは、分岐プリアンプおよびアンプDNAを使用して強烈で局在的なシグナルを生成し、DNAの反復領域を標的とすることに依存していた以前のハイブリダイゼーション法を改良します9。臨床現場での感染細胞は、ウイルス遺伝物質を豊富に含まないことが多く、診断現場での蛍光核酸検出のための高感度な方法のための商品を提供します。RNAスコープ7やViewRNA10などのアプローチによるbDNA技術の商業化は、このニッチを埋めました。bDNA蛍光イメージングの感度は、細胞生物学においても重要な有用性を有し、細胞培養モデルにおける希少な核酸種の検出を可能にします。感度の大幅な向上により、bDNAベースのイメージング法はウイルスの研究に適しています。ただし、潜在的な欠点は、これらの方法がRNAまたはRNAとタンパク質の視覚化に重点を置いていることです。すべての複製細胞と多くのウイルスは、複製サイクル中にDNAゲノムを持っているか、DNAを形成するため、RNAとDNAの両方、およびタンパク質をイメージングできる方法が非常に望まれています。
MICDDRPプロトコルでは、RNAスコープ法を使用してウイルス核酸を検出するためのbDNA FISHを実行し、修正7を行います。このプロトコルの主な変更の1つは、化学的固定後のプロテアーゼ処理の最適化です。プロテアーゼ処理は、核酸に結合したタンパク質の除去を容易にし、プローブハイブリダイゼーション効率を向上させます。プロテアーゼ処理に続いて、分岐オリゴヌクレオチドプローブとのインキュベーションを行います。bDNAプローブの適用後、サンプルを洗浄し、シグナルプリアンプおよびアンプDNAとともにインキュベートします。マルチプレックスin situハイブリダイゼーション(ISH)、複数の遺伝子標的の標識には、スペクトル分化のために異なるカラーチャネルを有するターゲットプローブが必要である7。DNAアンプによるインキュベーションの後に免疫蛍光(IF)が続きます。
bDNA ISHは、非特異的ハイブリダイゼーションイベントからのバックグラウンドノイズを低減しながら、標的特異的シグナルの増幅によってシグナル対ノイズの改善をもたらします7,11。ターゲットプローブは、非特異的ハイブリダイゼーション事象の確率を予測するとともに、プローブ−ターゲットハイブリッド7、11の融解温度(Tm)を計算する公に入手可能なソフトウェアプログラムを用いて設計される。ターゲットプローブは、ターゲットDNA/RNA配列に相補的な18〜25塩基の領域、スペーサー配列、および14塩基のテール配列を含む。それぞれ異なるテール配列を持つ一対のターゲットプローブは、標的領域(~50塩基に及ぶ)にハイブリダイズします。2つのテール配列は、プレアンププローブのためのハイブリダイゼーション部位を形成し、これは、増幅器プローブのための20の結合部位を含み、さらに、ラベルプローブのための20の結合部位を含む。一例として、核酸分子上の1キロ塩基(kb)領域を20個のプローブ対で標的とし、プリアンプ、アンプ、およびラベルプローブとのシーケンシャルハイブリダイゼーションのための分子足場を作成します。したがって、これにより、核酸分子あたり8000個の蛍光標識の理論収率が得られ、単一分子の検出が可能になり、従来のFISHアプローチ7(bDNAシグナル増幅の概略図については図1Aを参照)よりも大幅に改善されます。多重化ISH用のプローブを設定するには、各ターゲットプローブが異なるカラーチャンネル(C1、C2、またはC3)にある必要があります。異なるカラーチャンネルを持つこれらのターゲットプローブは、異なる14塩基のテールシーケンスを持っています。これらのテール配列は、異なるシグナル増幅器を異なる蛍光プローブと結合させるため、複数のターゲット間でのスペクトル微分が容易になります。提示されたプロトコルにおいて、ステップ9の表4は、標的プローブを蛍光標識することに関するさらなる情報を提供する。さらに、図2および図3は、HIV-1およびHTLV-1感染後に複数のウイルス核酸標的の特異的蛍光標識を達成するために、適切なAmplifier 4-FL(A、B、またはC)(蛍光プローブおよび最終ハイブリダイゼーションステップ)をどのように選択したかの例を示しています。
RNA、DNA、タンパク質の同時蛍光可視化のいくつかのアプリケーションを実証し、ウイルス複製の重要な段階を高い時空間分解能で観察しました3,4,5。例えば、ウイルスRNA、細胞質および核DNA、およびタンパク質の同時単一細胞可視化により、核侵入前の細胞質内のコアを含むRNAの追跡やプロウイルスDNA3の統合など、HIV-1感染中の重要なイベントを視覚化することができました。さらに、ウイルス感染と複製に対する宿主因子と薬物治療の効果を特徴付けるためにMICDDRPを適用しました4,5。Ukahらでは、HIV転写と潜時反転を視覚化するために、さまざまな潜伏反転剤で処理された潜伏細胞モデルにおけるHIV-1転写の再活性化を追跡しました4。さらに、MICDDRPにより、低分子処理や宿主因子の制限に起因する抗ウイルス阻害に関連する表現型の変化を視覚化することができます。私たちのアプローチの堅牢性と幅広い適用性の概念実証として、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)-1だけでなく、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)-1、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)にも感染を追跡するためにウイルス核酸を効率的に標識するためにプロトコルの変更を使用できることを実証しました。 ジカウイルス(ZIKV)、およびインフルエンザAウイルス(IAV)。HIV-1のライフサイクルはウイルスDNAとRNA種の両方で構成されているため、HIV-1複製動態に続いてMICDDRPの最適化の大部分を実行しました。しかし、それに加えて、ZIKV、IAV、HBV、HCVなどのウイルスにおけるセンス(+)およびアンチセンス(-)鎖のいずれかまたは両方の異なるウイルスRNA転写物の合成を追跡して、ウイルスの転写と複製をモニターできることを実証しました3,4,5,6。この研究は、いくつかのウイルスプロセスの機構的理解を向上させ、この蛍光イメージング技術を幅広い細胞モデルに実装するためのガイドラインとして機能することを目的としています。
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA、DNA、タンパク質を同時に可視化するには、多くの場合、広範な最適化が必要です。一般的に使用される2つの方法は、5-エチニル-2-デオキシウリジン(EdU)標識とDNA FISHです。EdUは新生DNAに組み込まれ、その後クリックケミストリー を介して アジド含有蛍光色素で標識されるため、EdU標識はウイルスDNAとタンパク質を同時に視覚化するために適用されています。したがって、EdU標識は?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所(R01 AI121315、R01 AI146017、R01 AI148382、R01 AI120860、R37 AI076119、およびU54 AI150472)によって全体的または部分的に支援されました。A型インフルエンザウイルスに感染した細胞を提供してくれたレイモンド・F・シナジ博士とサディ・アミチャイ博士に感謝します。
Materials
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
Referenzen
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