Одноклеточная мультиплексированная флуоресцентная визуализация для визуализации вирусных нуклеиновых кислот и белков и мониторинга ВИЧ, HTLV, HBV, HCV, вируса Зика и инфекции гриппа
Summary
Здесь представлен протокол для подхода флуоресцентной визуализации, multiplex immunofluorescent cell-based detection DNA, RNA и protein (MICDDRP), метод, способный одновременно флуоресцентной одноклеточной визуализации вирусного белка и нуклеиновых кислот различного типа и цепкости. Этот подход может быть применен к широкому спектру систем.
Abstract
Захват динамических процессов репликации и сборки вирусов был затруднен отсутствием надежных технологий гибридизации in situ (ISH), которые позволяют чувствительную и одновременную маркировку вирусных нуклеиновых кислот и белков. Обычные методы флуоресценции ДНК in situ гибридизации (FISH) часто не совместимы с иммуноокрашиванием. Поэтому мы разработали подход к визуализации , MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based d etection of DNA, RNA и protein), который позволяет одновременно проводить одноклеточную визуализацию ДНК, РНК и белка. По сравнению с обычной ДНК FISH, MICDDRP использует технологию разветвленной ДНК (bDNA) ISH, которая значительно улучшает чувствительность и обнаружение олигонуклеотидного зонда. Небольшие модификации MICDDRP позволяют визуализировать вирусные белки одновременно с нуклеиновыми кислотами (РНК или ДНК) различной нити. Мы применили эти протоколы для изучения жизненных циклов нескольких вирусных патогенов, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)-1, человеческий Т-лимфотропный вирус (HTLV)-1, вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус Зика (ZKV) и вирус гриппа A (IAV). Мы продемонстрировали, что можем эффективно маркировать вирусные нуклеиновые кислоты и белки в различных спектрах вирусов. Эти исследования могут предоставить нам улучшенное механистическое понимание множественных вирусных систем и, кроме того, служить шаблоном для применения мультиплексированной флуоресцентной визуализации ДНК, РНК и белка в широком спектре клеточных систем.
Introduction
В то время как тысячи коммерческих антител доступны для специфической маркировки белков с помощью обычных иммуноокрашающих подходов, и хотя слитые белки могут быть спроектированы с помощью фотооптимизированных флуоресцентных меток для отслеживания нескольких белков в образце1, микроскопическая визуализация белка часто не совместима с обычной флуоресцентной гибридизацией ДНК in situ (FISH)2 . Технические ограничения в одновременной визуализации ДНК, РНК и белка с использованием флуоресцентных подходов препятствовали глубокому пониманию репликации вируса. Отслеживание как вирусной нуклеиновой кислоты, так и белка во время течения инфекции позволяет вирусологам визуализировать фундаментальные процессы, которые лежат в основе репликации и сборки вируса 3,4,5,6.
Мы разработали подход к визуализации, multiplex immunofluorescent cell-based detection DNA, RNA и Protein (MICDDRP)3, который использует технологию разветвленной ДНК (bDNA) in situ для повышения чувствительности обнаружения нуклеиновых кислот 7,8,9 . Кроме того, этот метод использует парные зонды для повышения специфичности. Зонды, специфичные для последовательности bDNA, используют ветвящиеся предусилители и усилители ДНК для получения интенсивного и локализованного сигнала, улучшая предыдущие методы гибридизации, которые основывались на нацеливании на повторяющиеся области в ДНК9. Инфицированные клетки в клиническом контексте часто не содержат обильного вирусного генетического материала, обеспечивая товар для чувствительного метода обнаружения флуоресцентных нуклеиновых кислот в диагностических условиях. Коммерциализация технологии бДНК с помощью таких подходов, как RNAscope7 и ViewRNA10, заполнила эту нишу. Чувствительность флуоресцентной визуализации бДНК также имеет важное значение в клеточной биологии, позволяя обнаруживать редкие виды нуклеиновых кислот в моделях клеточных культур. Значительное улучшение чувствительности делает методы визуализации на основе бДНК подходящими для изучения вирусов. Потенциальный недостаток, однако, заключается в том, что эти методы сосредоточены на визуализации РНК или РНК и белка. Все реплицирующиеся клетки и многие вирусы имеют геном ДНК или образуют ДНК во время цикла репликации, что делает методы, способные визуализировать как РНК, так и ДНК, а также белок, очень желательными.
В протоколе MICDDRP мы выполняем bDNA FISH для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот с использованием метода RNAscope, с модификациями7. Одной из основных модификаций этого протокола является оптимизация обработки протеазой после химической фиксации. Лечение протеазой облегчает удаление белков, связанных с нуклеиновой кислотой, для повышения эффективности гибридизации зонда. Лечение протеазой сопровождается инкубацией с разветвленным олигонуклеотидным зондом (зонами). После применения зонда (зондов) бДНК образцы промывают и впоследствии инкубируют с предварительным усилителем сигнала и усилителем ДНК. Мультиплексированная гибридизация in situ (ISH), маркировка нескольких генных мишеней, требует целевых зондов с различными цветовыми каналами для спектральной дифференцировки7. Инкубация с усилителями ДНК сопровождается иммунофлуоресценцией (ИФ).
bDNA ISH обеспечивает улучшение сигнал-шум путем усиления сигналов, специфичных для цели, с уменьшением фонового шума от неспецифических событий гибридизации 7,11. Целевые зонды разрабатываются с использованием общедоступных программ, которые предсказывают вероятность неспецифических событий гибридизации, а также вычисляют температуру плавления (Т-м) гибрида зонд-мишень 7,11. Целевые зонды содержат 18-25-базовую область, комплементарную целевой последовательности ДНК / РНК, спейсерную последовательность и 14-базовую хвостовую последовательность. Пара целевых зондов, каждый с отдельной хвостовой последовательностью, гибридизируется с целевой областью (охватывающей ~ 50 оснований). Две хвостовые последовательности образуют сайт гибридизации для датчиков предварительного усилителя, которые содержат 20 сайтов связывания для датчиков усилителя, которые, кроме того, содержат 20 сайтов связывания для зонда метки. Например, область одного килобаза (кб) на молекуле нуклеиновой кислоты нацелена на 20 зондовых пар, создавая молекулярный каркас для последовательной гибридизации с предусилителем, усилителем и зондом метки. Таким образом, это может привести к теоретическому выходу 8000 флуоресцентных меток на молекулу нуклеиновой кислоты, что позволяет обнаруживать отдельные молекулы и значительно улучшать по сравнению с обычными подходамиFISH 7 (см. Рисунок 1A для схемы усиления сигнала бДНК). Чтобы настроить зонды для мультиплексированного ISH, каждый целевой зонд должен находиться в другом цветовом канале (C1, C2 или C3). Эти целевые зонды с различными цветовыми каналами имеют различные 14-базовые хвостовые последовательности. Эти хвостовые последовательности будут связывать различные усилители сигнала с различными флуоресцентными зондами, что позволит легкой спектральной дифференциации по нескольким мишеням. В представленном Протоколе, таблица 4 на этапе 9, содержит дополнительную информацию о флуоресцентной маркировке целевых зондов. Кроме того, на рисунках 2 и 3 приведены примеры того, как мы выбрали соответствующий усилитель 4-FL (A, B или C) (флуоресцентный зонд и заключительная стадия гибридизации) для достижения специфической флуоресцентной маркировки нескольких мишеней вирусных нуклеиновых кислот после инфекций ВИЧ-1 и HTLV-1.
Мы продемонстрировали несколько применений одновременной флуоресцентной визуализации РНК, ДНК и белков, наблюдая критические стадии репликации вируса с высоким пространственно-временным разрешением 3,4,5. Например, одновременная одноклеточная визуализация вирусной РНК, цитоплазматической и ядерной ДНК и белка позволила нам визуализировать ключевые события во время заражения ВИЧ-1, в том числе следование РНК, содержащей ядра в цитоплазме, до входа в ядер и интеграции провирусной ДНК3. Кроме того, мы применили MICDDRP для характеристики влияния факторов хозяина и медикаментозного лечения на вирусную инфекцию и репликацию 4,5. В Ukah et al. мы отслеживали реактивацию транскрипции ВИЧ-1 в моделях латентных клеток, обработанных различными агентами, реверсирующими латентность, для визуализации транскрипции ВИЧ и обращения латентности4. Кроме того, MICDDRP может позволить нам визуализировать фенотипические изменения, связанные с противовирусным ингибированием, приписываемые лечению малыми молекулами или ограничению фактора хозяина. В качестве доказательства концепции надежности и широкой применимости нашего подхода мы продемонстрировали, что мы можем использовать модификации нашего протокола для эффективной маркировки вирусной нуклеиновой кислоты для отслеживания инфекции не только вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)-1, но и человеческим Т-лимфотропным вирусом (HTLV)-1, вирусом гепатита В (HBV), вирусом гепатита С (HCV), Вирус Зика (ZIKV) и вирус гриппа А (IAV). Поскольку жизненный цикл ВИЧ-1 состоит как из вирусной ДНК, так и из видов РНК, мы выполнили большую часть нашей оптимизации MICDDRP после кинетики репликации ВИЧ-1. Однако, кроме того, мы продемонстрировали, что мы можем отслеживать синтез различных вирусных транскриптов РНК одной или обеих чувств (+) и антисмысловой (-) нити у вирусов, таких как ZIKV, IAV, HBV и HCV, для мониторинга вирусной транскрипции и репликации 3,4,5,6. Исследования направлены на улучшение механистического понимания нескольких вирусных процессов и служат руководством для реализации этой технологии флуоресцентной визуализации в широком спектре клеточных моделей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одновременная визуализация РНК, ДНК и белка часто требует обширной оптимизации. Двумя широко используемыми методами являются маркировка 5-этинил-2-дезоксиуридина (EdU) и ДНК FISH. Маркировка EdU была применена для визуализации вирусной ДНК и белка одновременно, поскольку EdU включен в зарожда…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана полностью или частично Национальными институтами здравоохранения (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 и U54 AI150472). Мы благодарим д-ра Раймонда Ф. Шинази и Сэди Амичай за предоставление клеток, инфицированных вирусом гриппа А.
Materials
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
Referenzen
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
