Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza
Summary
Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.
Abstract
La captura de los procesos dinámicos de replicación y ensamblaje de virus se ha visto obstaculizada por la falta de tecnologías robustas de hibridación in situ (ISH) que permitan el etiquetado sensible y simultáneo de ácidos nucleicos y proteínas virales. Los métodos convencionales de hibridación in situ por fluorescencia de ADN (FISH) a menudo no son compatibles con la inmunotinción. Por lo tanto, hemos desarrollado un enfoque de imagen, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein), que permite la visualización simultánea de ADN, ARN y proteína en una sola célula. En comparación con los peces de ADN convencionales, MICDDRP utiliza la tecnología ISH de ADN ramificado (ADNb), que mejora drásticamente la sensibilidad y detección de la sonda de oligonucleótidos. Pequeñas modificaciones de MICDDRP permiten obtener imágenes de proteínas virales concomitantemente con ácidos nucleicos (ARN o ADN) de diferentes cadenas. Hemos aplicado estos protocolos para estudiar los ciclos de vida de múltiples patógenos virales, incluido el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1, el virus linfotrópico T humano (HTLV)-1, el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), el virus del Zika (ZKV) y el virus de la influenza A (IAV). Demostramos que podemos etiquetar eficientemente los ácidos nucleicos y las proteínas virales en una amplia gama de virus. Estos estudios pueden proporcionarnos una mejor comprensión mecanicista de múltiples sistemas virales y, además, servir como plantilla para la aplicación de imágenes de fluorescencia multiplexada de ADN, ARN y proteínas en un amplio espectro de sistemas celulares.
Introduction
Si bien hay miles de anticuerpos comerciales disponibles para etiquetar específicamente las proteínas a través de enfoques convencionales de inmunotinción, y mientras que las proteínas de fusión se pueden diseñar con etiquetas fluorescentes fotooptimizadas para rastrear múltiples proteínas en una muestra1, la visualización microscópica de proteínas a menudo no es compatible con la hibridación in situ de fluorescencia de ADN convencional (FISH)2 . Las limitaciones técnicas en la visualización simultánea de ADN, ARN y proteínas utilizando enfoques basados en fluorescencia han obstaculizado la comprensión profunda de la replicación del virus. El seguimiento tanto del ácido nucleico viral como de la proteína durante el curso de la infección permite a los virólogos visualizar los procesos fundamentales que subyacen a la replicación y ensamblaje del virus 3,4,5,6.
Hemos desarrollado un enfoque de imagen, la detección dbasada en ml ultiplex immunofluorescent cell-based de DNA, RNA y Protein (MICDDRP)3, que utiliza la tecnología in situ de ADN ramificado (ADNb) para mejorar la sensibilidad de ladetección de ácidos nucleicos 7,8,9 . Además, este método utiliza sondas pareadas para mejorar la especificidad. Las sondas específicas de secuencia de ADNb utilizan ADN de preamplificador ramificado y amplificador para producir una señal intensa y localizada, mejorando los métodos de hibridación anteriores que se basaban en apuntar a regiones repetidas en el ADN9. Las células infectadas en un contexto clínico a menudo no contienen abundante material genético viral, proporcionando un producto para un método sensible para la detección de ácidos nucleicos fluorescentes en entornos de diagnóstico. La comercialización de la tecnología bDNA a través de enfoques como RNAscope7 y ViewRNA10 han llenado este nicho. La sensibilidad de las imágenes de fluorescencia de ADNb también tiene una utilidad importante en biología celular, permitiendo la detección de especies escasas de ácidos nucleicos en modelos de cultivo celular. La gran mejora de la sensibilidad hace que los métodos de imagen basados en ADNb sean adecuados para estudiar virus. Una deficiencia potencial, sin embargo, es que estos métodos se centran en la visualización de ARN o ARN y proteína. Todas las células replicantes y muchos virus tienen genomas de ADN o forman ADN durante su ciclo de replicación, lo que hace que los métodos capaces de obtener imágenes tanto de ARN como de ADN, así como proteínas, sean altamente deseables.
En el protocolo MICDDRP, realizamos bDNA FISH para la detección de ácido nucleico viral utilizando el método RNAscope, con modificaciones7. Una de las principales modificaciones de este protocolo es la optimización del tratamiento con proteasa después de la fijación química. El tratamiento con proteasa facilita la eliminación de proteínas unidas al ácido nucleico para mejorar la eficiencia de la hibridación de la sonda. El tratamiento con proteasa es seguido por la incubación con sondas de oligonucleótidos ramificados. Después de la aplicación de las sondas de ADNb, las muestras se lavan y posteriormente se incuban con ADN de preamplificador de señal y amplificador. La hibridación in situ multiplexada (ISH), el etiquetado de múltiples dianas génicas requiere sondas diana con diferentes canales de color para la diferenciación espectral7. La incubación con amplificadores de ADN es seguida por inmunofluorescencia (IF).
bDNA ISH imparte mejoras en la relación señal-ruido mediante la amplificación de señales específicas del objetivo, con una reducción del ruido de fondo de eventos de hibridación no específicos 7,11. Las sondas objetivo se diseñan utilizando programas de software disponibles públicamente que predicen la probabilidad de eventos de hibridación no específicos, así como calculan la temperatura de fusión (Tm) del híbrido sonda-objetivo 7,11. Las sondas objetivo contienen una región de 18 a 25 bases complementaria a la secuencia de ADN/ARN objetivo, una secuencia de espaciador y una secuencia de cola de 14 bases. Un par de sondas objetivo, cada una con una secuencia de cola distinta, se hibridan a una región objetivo (que abarca ~ 50 bases). Las dos secuencias de cola forman un sitio de hibridación para las sondas del preamplificador, que contienen 20 sitios de unión para las sondas del amplificador, que, además, contienen 20 sitios de unión para la sonda de etiqueta. Como ejemplo, una región de un kilobase (kb) en la molécula de ácido nucleico es objetivo de 20 pares de sondas, creando un andamio molecular para la hibridación secuencial con el preamplificador, el amplificador y la sonda de etiqueta. Por lo tanto, esto puede conducir a un rendimiento teórico de 8000 etiquetas fluorescentes por molécula de ácido nucleico, lo que permite la detección de moléculas individuales y grandes mejoras sobre los enfoques convencionales de FISH7 (Ver Figura 1A para el esquema de amplificación de señales de ADNb). Para configurar sondas para ISH multiplexado, cada sonda de destino debe estar en un canal de color diferente (C1, C2 o C3). Estas sondas objetivo con diferentes canales de color poseen distintas secuencias de cola de 14 bases. Estas secuencias de cola se unirán a distintos amplificadores de señal con diferentes sondas fluorescentes, lo que permitirá una fácil diferenciación espectral a través de múltiples objetivos. En el Protocolo presentado, la Tabla 4 en el Paso 9, proporciona más información sobre el etiquetado fluorescente de las sondas objetivo. Además, la Figura 2 y la Figura 3 proporcionan ejemplos de cómo elegimos el amplificador 4-FL (A, B o C) apropiado (sonda fluorescente y el paso final de hibridación) para lograr un etiquetado fluorescente específico de múltiples objetivos de ácido nucleico viral después de las infecciones por VIH-1 y HTLV-1.
Hemos demostrado varias aplicaciones de visualización simultánea de fluorescencia de ARN, ADN y proteínas, observando etapas críticas de replicación del virus con alta resolución espaciotemporal 3,4,5. Por ejemplo, la visualización simultánea de una sola célula de ARN viral, ADN citoplasmático y nuclear y proteínas nos ha permitido visualizar eventos clave durante la infección por VIH-1, incluido el seguimiento de núcleos que contienen ARN en el citoplasma antes de la entrada nuclear y la integración del ADN proviral3. Además, hemos aplicado MICDDRP para caracterizar los efectos de los factores del huésped y el tratamiento farmacológico sobre la infección viral y la replicación 4,5. En Ukah et al., rastreamos la reactivación de la transcripción del VIH-1 en modelos de células de latencia tratados con diferentes agentes de reversión de latencia para visualizar la transcripción del VIH y la reversión de la latencia4. Además, MICDDRP puede permitirnos visualizar cambios fenotípicos asociados con la inhibición antiviral atribuida al tratamiento de moléculas pequeñas o la restricción del factor huésped. Como prueba de concepto de la solidez y amplia aplicabilidad de nuestro enfoque, hemos demostrado que podemos utilizar modificaciones de nuestro protocolo para etiquetar eficientemente el ácido nucleico viral para seguir la infección no solo en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1, sino también en el virus linfotrópico T humano (HTLV)-1, el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), Virus del Zika (ZIKV) y virus de la influenza A (IAV). Como el ciclo de vida del VIH-1 consiste en especies de ADN y ARN virales, hemos realizado la mayor parte de nuestra optimización de MICDDRP siguiendo la cinética de replicación del VIH-1. Sin embargo, además, hemos demostrado que podemos rastrear la síntesis de diferentes transcripciones de ARN viral de uno o ambos nervios de sentido (+) y antisentido (-) en virus como ZIKV, IAV, HBV y VHC para monitorear la transcripción y replicación viral 3,4,5,6. Los estudios tienen como objetivo mejorar la comprensión mecanicista de varios procesos virales y servir como guía para implementar esta tecnología de imágenes de fluorescencia en una amplia gama de modelos celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
La visualización simultánea de ARN, ADN y proteína a menudo requiere una optimización extensa. Dos métodos comúnmente utilizados son el etiquetado de 5-etinil-2-desoxiuridina (EdU) y DNA FISH. El etiquetado de EdU se ha aplicado para visualizar el ADN viral y la proteína simultáneamente, ya que EdU se incorpora en el ADN naciente y posteriormente se marca con colorantes fluorescentes que contienen azida a través de la química de clic. Por lo tanto, el etiquetado EdU se puede utilizar para monitorear la…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en su totalidad o en parte por los Institutos Nacionales de Salud (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 y U54 AI150472). Agradecemos al Dr. Raymond F. Schinazi y Sadie Amichai por proporcionar células infectadas con el virus de la influenza A.
Materials
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
Referenzen
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