הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.
Abstract
לכידת תהליכי השכפול וההרכבה הדינמיים של וירוסים הופרעה על ידי היעדר טכנולוגיות הכלאה חזקות באתרן (ISH) המאפשרות תיוג רגיש ובו-זמני של חומצת גרעין וחלבון נגיפיים. שיטות קונבנציונליות של הכלאה פלואורסצנטית של דנ”א באתרן (FISH) לרוב אינן תואמות את האימונוסטינינג. לכן פיתחנו גישת הדמיה, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based d etection של DNA, RNA ו-protein), המאפשרת הדמיה סימולטנית של דנ”א, רנ”א וחלבון. בהשוואה לדגי דנ”א רגילים, MICDDRP משתמש בטכנולוגיית DNA מסועפת (bDNA) ISH, המשפרת באופן דרמטי את הרגישות והזיהוי של בדיקת אוליגונוקלאוטידים. שינויים קטנים של MICDDRP מאפשרים הדמיה של חלבונים נגיפיים במקביל לחומצות גרעין (RNA או DNA) של גדילים שונים. יישמנו את הפרוטוקולים האלה כדי לחקור את מחזורי החיים של פתוגנים נגיפיים מרובים, כולל נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1, נגיף T-לימפוטרופי אנושי (HTLV)-1, נגיף הפטיטיס B (HBV), נגיף הפטיטיס C (HCV), נגיף זיקה (ZKV) ונגיף שפעת A (IAV). הדגמנו שאנחנו יכולים לתייג ביעילות חומצות גרעין וחלבונים נגיפיים במגוון רחב של נגיפים. מחקרים אלה יכולים לספק לנו הבנה מכניסטית משופרת של מערכות נגיפיות מרובות, ובנוסף, לשמש כתבנית ליישום הדמיה פלואורסצנטית מרובת של דנ”א, רנ”א וחלבון על פני ספקטרום רחב של מערכות תאיות.
Introduction
בעוד שאלפי נוגדנים מסחריים זמינים לתיוג ספציפי של חלבונים באמצעות גישות אימונוסטיזציה קונבנציונליות, ובעוד שניתן להנדס חלבוני היתוך באמצעות תגים פלואורסצנטיים שעברו אופטימיזציה לפוטו-אופטימיזציה למעקב אחר חלבונים מרובים בדגימה1, הדמיה מיקרוסקופית של חלבון לרוב אינה תואמת להכלאה פלואורסצנטית קונבנציונלית של DNA באתרה (FISH)2 . מגבלות טכניות בהדמיה סימולטנית של דנ”א, רנ”א וחלבון באמצעות גישות מבוססות פלואורסצנציה הפריעו להבנה מעמיקה של שכפול הנגיף. מעקב אחר חומצת גרעין נגיפית וחלבון במהלך ההדבקה מאפשר לווירולוגים לדמיין תהליכים בסיסיים העומדים בבסיס שכפול הנגיףוהרכבתו 3,4,5,6.
פיתחנו גישת הדמיה, multiplex immunofluorescent cell-based d etection של DNA, RNA ו- Protein (MICDDRP)3, המשתמשת בדנ”א מסועף (bDNA) בטכנולוגיית situ כדי לשפר את הרגישות של זיהוי חומצות גרעין 7,8,9 . בנוסף, שיטה זו משתמשת בבדיקות מזווגות לספציפיות משופרת. בדיקות ספציפיות לרצף bDNA משתמשות ב-DNAs של קדם-מגבר ומגבר מסתעפים כדי לייצר אות אינטנסיבי ומקומי, ולשפר את שיטות ההכלאה הקודמות שהסתמכו על מיקוד באזורים חוזרים בדנ”א9. תאים נגועים בהקשר קליני לעתים קרובות אינם מכילים חומר גנטי ויראלי בשפע, ומספקים מצרך לשיטה רגישה לזיהוי חומצות גרעין פלואורסצנטיות במסגרות אבחון. המסחור של טכנולוגיית bDNA באמצעות גישות כגון RNAscope7 ו- ViewRNA10 מילאו נישה זו. לרגישות של דימות פלואורסצנטי bDNA יש גם תועלת חשובה בביולוגיה של התא, והיא מאפשרת זיהוי של מיני חומצות גרעין נדירים במודלים של תרביות תאים. השיפור העצום ברגישות הופך את שיטות ההדמיה מבוססות ה-bDNA למתאימות לחקר וירוסים. חסרון פוטנציאלי, עם זאת, הוא ששיטות אלה מתמקדות בהדמיה של רנ”א או רנ”א וחלבון. לכל התאים המשוכפלים ולנגיפים רבים יש גנומים של דנ”א או שהם יוצרים דנ”א במהלך מחזור השכפול שלהם, מה שהופך את השיטות המסוגלות לדמות גם רנ”א וגם דנ”א, כמו גם חלבון, לרצויות מאוד.
בפרוטוקול MICDDRP אנו מבצעים bDNA FISH לזיהוי חומצת גרעין נגיפית בשיטת RNAscope, עם שינויים7. אחד השינויים העיקריים בפרוטוקול זה הוא אופטימיזציה של טיפול בפרוטאז בעקבות קיבוע כימי. טיפול בפרוטאז מקל על הסרת חלבונים הקשורים לחומצת גרעין כדי לשפר את יעילות הכלאת הבדיקה. הטיפול בפרוטאז מלווה בדגירה עם גשושיות אוליגונוקלאוטידים מסועפות. לאחר יישום של בדיקות bDNA, דגימות נשטפות ולאחר מכן מודגרות עם DNAs קדם-מגבר אות ומגבר. הכלאה מרובבת באתרה (ISH), תיוג של מטרות גנים מרובות, דורשת בדיקות מטרה עם ערוצי צבע שונים להתמיינות ספקטרלית7. דגירה עם מגברי DNA מלווה באימונופלואורסצנציה (IF).
bDNA ISH מקנה שיפורים באותות לרעש על ידי הגברה של אותות ספציפיים למטרה, עם הפחתה לרעשי רקע מאירועי הכלאה לא ספציפיים 7,11. גשושיות מטרה מתוכננות באמצעות תוכנות הזמינות לציבור המנבאות את ההסתברות לאירועי הכלאה לא ספציפיים, כמו גם חישוב טמפרטורת התכה (Tm) של הגשושית-מטרה ההיברידית 7,11. גשושיות המטרה מכילות אזור של 18 עד 25 בסיסים המשלים את רצף הדנ”א/רנ”א של המטרה, רצף ספייסר ורצף זנב של 14 בסיסים. זוג גשושיות מטרה, שלכל אחת מהן רצף זנב מובחן, משתלבות לאזור מטרה (המשתרע על פני ~50 בסיסים). שני רצפי הזנב יוצרים אתר הכלאה עבור הגשושיות שלפני המגבר, המכילות 20 אתרי קישור עבור הגשושיות של המגבר, אשר בנוסף מכילות 20 אתרי קישור עבור גשושית התווית. לדוגמה, אזור של קילו-בסיס אחד (kb) על מולקולת חומצת הגרעין ממוקד על ידי 20 זוגות גשושיות, ויוצר פיגום מולקולרי להכלאה רציפה עם הקדם-מגבר, המגבר והגשושית התווית. זה יכול אפוא להוביל לתפוקה תיאורטית של 8000 תוויות פלואורסצנטיות לכל מולקולת חומצת גרעין, מה שמאפשר זיהוי של מולקולות בודדות ושיפורים עצומים לעומת גישות FISHקונבנציונליות 7 (ראו איור 1A לסכימות של הגברת אותות bDNA). כדי להגדיר בדיקות עבור ISH מרובב, כל בדיקת יעד חייבת להיות בערוץ צבע אחר (C1, C2 או C3). גשושיות מטרה אלה עם ערוצי צבע שונים הן בעלות רצפי זנב שונים של 14 בסיסים. רצפי זנב אלה יקשרו מגברי אותות שונים עם גשושיות פלואורסצנטיות שונות, ובכך יאפשרו התמיינות ספקטרלית על פני מטרות מרובות. בפרוטוקול המוצג, טבלה 4 בשלב 9, מספקת מידע נוסף על תיוג פלואורסצנטי של בדיקות מטרה. בנוסף, איור 2 ואיור 3 מספקים דוגמאות לאופן שבו בחרנו את המגבר המתאים 4-FL (A, B או C) (בדיקה פלואורסצנטית ושלב ההכלאה הסופי) כדי להשיג תיוג פלואורסצנטי ספציפי של מטרות מרובות של חומצות גרעין נגיפיות בעקבות זיהומים ב-HIV-1 וב-HTLV-1.
הדגמנו מספר יישומים של הדמיה פלואורסצנטית סימולטנית של RNA, DNA וחלבונים, תוך התבוננות בשלבים קריטיים של שכפול הנגיף ברזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה 3,4,5. לדוגמה, הדמיה סימולטנית של רנ”א נגיפי, דנ”א ציטופלסמי וגרעיני וחלבון אפשרה לנו לדמיין אירועי מפתח במהלך הידבקות ב-HIV-1, כולל מעקב אחר רנ”א המכיל ליבות בציטופלסמה לפני הכניסה הגרעינית ושילוב של דנ”א פרו-ויראלי3. בנוסף, יישמנו MICDDRP כדי לאפיין את ההשפעות של גורמים מארחים וטיפול תרופתי על זיהום ויראלי ושכפול 4,5. ב- Ukah et al., עקבנו אחר הפעלה מחדש של שעתוק HIV-1 במודלים של תאי חביון שטופלו בסוכני היפוך חביון שונים כדי לדמיין שעתוק HIV והיפוך חביון4. בנוסף, MICDDRP יכול לאפשר לנו לדמיין שינויים פנוטיפיים הקשורים עיכוב אנטי ויראלי המיוחס לטיפול במולקולות קטנות או הגבלת גורם מארח. כהוכחת היתכנות לעמידות ולתחולה הרחבה של הגישה שלנו, הוכחנו שאנו יכולים להשתמש בשינויים של הפרוטוקול שלנו כדי לתייג ביעילות חומצת גרעין נגיפית כדי לעקוב אחר זיהום לא רק בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1, אלא גם בנגיף T-לימפוטרופי אנושי (HTLV)-1, נגיף הפטיטיס B (HBV), נגיף הפטיטיס C (HCV), נגיף זיקה (ZIKV), ונגיף שפעת A (IAV). מכיוון שמחזור החיים של HIV-1 מורכב הן ממיני דנ”א נגיפיים והן ממיני RNA, ביצענו את רוב האופטימיזציה של MICDDRP בעקבות קינטיקה של שכפול HIV-1. עם זאת, בנוסף, הוכחנו כי אנו יכולים לעקוב אחר סינתזה של תעתיקי RNA נגיפיים שונים של גדילי החוש (+) והאנטיסנס (-) או שניהם בנגיפים כגון ZIKV, IAV, HBV ו- HCV כדי לעקוב אחר שעתוק ושכפול נגיפי 3,4,5,6. מטרת המחקרים היא לשפר את ההבנה המכניסטית של מספר תהליכים נגיפיים ולשמש קו מנחה ליישום טכנולוגיית הדמיה פלואורסצנטית זו במגוון רחב של מודלים תאיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדמיה סימולטנית של RNA, DNA וחלבון דורשת לעתים קרובות אופטימיזציה נרחבת. שתי שיטות נפוצות הן תיוג 5-אתיניל-2-דאוקסיורידין (EdU) ודגי DNA. תיוג EdU יושם כדי לדמיין דנ”א ויראלי וחלבון בו זמנית, שכן EdU משולב בדנ”א מתהווה ולאחר מכן מתויג עם צבעים פלואורסצנטיים המכילים אזיד באמצעות כימיה של קליקים. לפ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה במלואה או בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 ו- U54 AI150472). אנו מודים לד”ר ריימונד פ. שינזי וסיידי עמיחי על אספקת תאים נגועים בנגיף שפעת A.
Materials
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
Referenzen
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
