تقييم إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج ماوس متلازمة المبيض المتعدد الكيسات
Summary
تصف هذه الدراسة القياس المباشر لإنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج فأر متلازمة المبيض المتعدد الكيسات باستخدام متتبع جلوكوز نظائري مستقر عبر الوريد الخلفي في كل من حالات الصيام والجلوكوز الغنية بالجلوكوز جنبا إلى جنب.
Abstract
متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS) هو مرض شائع يؤدي إلى اضطرابات في استقلاب الجلوكوز، مثل مقاومة الأنسولين وعدم تحمل الجلوكوز. استقلاب الجلوكوز Dysregulated هو مظهر مهم من مظاهر المرض وهو المفتاح لمسببات الأمراض. لذلك، فإن الدراسات التي تنطوي على تقييم استقلاب الجلوكوز في PCولين الكلور ذات أهمية قصوى. وقد حددت دراسات قليلة جدا إنتاج الجلوكوز الكبدي مباشرة في نماذج PC أو إس باستخدام متتبعات الجلوكوز غير المشعة. في هذه الدراسة، نناقش التعليمات خطوة بخطوة لقياس كمي لمعدل إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج فأرة PC أو سي إس من خلال قياس إثراء M+2 من الجلوكوز [6,6-2H2]، وهو متتبع مستقر للجلوكوز النظيري، عن طريق كروماتوغرافيا الغاز – قياس الطيف الكتلي (GCMS). يتضمن هذا الإجراء إنشاء محلول مستقر لتتبع الجلوكوز النظيري ، واستخدام موضع قسطرة الوريد الذيل وضخ متتبع الجلوكوز في كل من حالات الصيام والجلوكوز الغنية في نفس الماوس جنبا إلى جنب. يتم قياس إثراء [6,6-2H2] الجلوكوز باستخدام مشتق بنتاسيتات في GCMS. ويمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة واسعة من الدراسات التي تنطوي على قياس مباشر لمعدل إنتاج الجلوكوز الكبدي.
Introduction
متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS) هو اضطراب شائع يحدث في 12٪ -20٪ من النساء في سن الإنجاب1،2. وهو مرض معقد يؤدي إلى أنماط الظاهرية المتغيرة التي تنطوي على المبيضين المتعدد الكيسات، الحيض غير النظامية والأدلة السريرية أو المختبرية من فرط الذكورة، وعادة ما يتم تشخيص عندما تلبي المرأة اثنين من المعايير الثلاثة3. أحد الجوانب السائدة في متلازمة تكيس المبايض، والعامل الرئيسي في مسببات الأمراض، هو الاختلالات الأيضية الموجودة في النساء المصابات بالمرض. النساء المصابات بمتلازمة تكيس المبايض أكثر من حالات مقاومة الأنسولين، وعدم تحمل الجلوكوز، والسمنة، ومتلازمة التمثيل الغذائي3،4،5،6. مقاومة الأنسولين ليست مجرد مظهر من مظاهر المرض، ولكن يعتقد أن تسهم في الإمراض من خلال قوة عمل هرمون اللوتين في المبيض مما يؤدي إلى زيادة إنتاج الاندروجين7،8. ويعتقد أن مقاومة الأنسولين لها العديد من الأصول المحتملة ولكن الدراسات تشير إلى أنه قد يكون بسبب أنماط غير طبيعية من مستقبلات الأنسولين مما يشير إلى 9,10. وقد قيمت الدراسات مقاومة الأنسولين في مرضى PCولينوس باستخدام تقنية معيار الذهب من المشبك hyperinsulinemic-euglycemic11,12,13,14,15. النساء المصابات بذلك، بغض النظر عن مؤشر كتلة الجسم، يتمتعن بمستويات أعلى من مقاومة الأنسولين مقارنة بالضوابط. يضعف التحكم في الأنسولين على إنتاج الجلوكوز في اضطرابات مقاومة الأنسولين مما يؤدي إلى إنتاج الجلوكوز الزائد. على سبيل المثال، مرضى السكري قد زادت معدلات جلوكونيوجينيسيس وضعف قمع انحلال الجليكوجين16. وعلاوة على ذلك، لوحظ ضعف قمع إنتاج الجلوكوز في الفئران السكري17. على الرغم من أن الدراسات المشبك يمكن أن تعطي قياس مقاومة الأنسولين، إلا أن القليل من الدراسات في PCولين مبايسول الخماسي الكلور تركز على القياس المباشر لإنتاج الجلوكوز في حالات الصيام والتغذية. وهذا يتطلب استخدام ضخ متتبع الجلوكوز غير المشع وقياسه عن طريق قياس الطيف الكتلي.
وقد استخدمت نماذج الحيوانات على نطاق واسع في بحوث PCOS. تم إنشاء كل من نماذج العجاف والسمنة من نوع PCوس مورين عن طريق إدارة الاندروجين قبل الولادة, prepubertally, أو ما بعد pubertally18. نماذج القوارض متلازمة تكيس المبايض تظهر أيضا الاختلافات الأيضية مقارنة مع الضوابط الخاصة بهم. أظهرت البيانات السابقة من مختبرنا اختبارات تحمل الجلوكوز غير الطبيعية (GTT) في نماذج فأرة PCOS (الهزيل والبدناء) ، بما يتفق مع أدب PCOS البشري19. استخدام نموذج العجاف والسمنة يسمح بمزيد من التحقيق في الاختلافات الأيضية. على وجه التحديد، يسمح هذا النموذج بتقييم معدل إنتاج الجلوكوز مباشرة باستخدام متتبعات الجلوكوز النظيرية. واحدة من الأكثر استخداما مستقرة تتبع الجلوكوز النظائري هو [6,6-2H2]الجلوكوز. [6,6-2H2]يمكن قياس إثراء الجلوكوز باستخدام مشتق بنتاسيتات كما هو موضح سابقا20.
في هذه الدراسة، كان هدفنا هو قياس معدل إنتاج الجلوكوز الكبدي في حالة الصيام والجلوكوز الغنية في فئران PC أو إس باستخدام ضخ الجلوكوز النظائري. ويمكن تطبيق هذه التقنيات على مجموعة واسعة من التجارب التي تنطوي على حركية الجلوكوز.
Protocol
Representative Results
Discussion
فرط السكر في الدم والتمثيل الغذائي غير طبيعي الجلوكوز / التوازن هي ملامح PCOS. يتم الحفاظ على مستوى السكر في الدم من خلال مزيج من الجلوكوز من النظام الغذائي وإنتاج الجلوكوز عن طريق انحلال الجليكوجين وجلوكونيوجينيسيس و جليكوجينيسيس، تحت سيطرة الهرمونات والإنزيمات. يتم قمع إنتاج الجلوك?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح التدريب من قبل قسم أمراض النساء والتوليد، وكلية بايلور للطب (ALG) ومنحة البحث R-01 (منحة # DK114689) لCSB، SC وJM من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 0.9% sodium chloride solution | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | VWR | 75846-756 | Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution) |
| 1-inch clear transpore tape | 3M | 70200400169 | |
| 1-inch Labeling tape | Fisher | GS07F161BA | Brand is example |
| 5 mL syringe containing heparanized saline flush | McKesson | 191-MIH-2235 | One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride) |
| 5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm if animal is between 2 and 6 months |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Advanced hot plate stirrer | VWR | 97042-602 | Brand is example |
| BD 27 gauge 0.5 inch needles | Health Warehouse | A283952 | |
| BD 30 gauge 0.5 inch needles | Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| Beaker, 1000 mL | Any brand | ||
| Caging pellets | |||
| Clear VOA glass vials with closed-top cap | Fisher Scientific | 05-719-120 | For storage of acetone and blood draw samples |
| Copper toothless alligator clamp for tourniquet | Amazon | Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper | |
| D-(+)-glucose >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-glucose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
| Magnifying glass | Amazon | Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand | |
| Microbalance | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Any similar model with 0.0001g accuracy can be used |
| Nalgene bottle, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom |
| PHD Ultra multi-syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
| Plexiglass sheet | Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion | ||
| Plexiglass sheets and dividers | Any brand; used to cage mice during infusion |
Referenzen
- March, W. A., et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria. Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).
- Yildiz, B. O., et al. Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria. Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).
- . Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).
- Goodarzi, M. O., et al. Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis. Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).
- Azziz, R. Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).
- Baskind, N. E., Balen, A. H. Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome. Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).
- Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).
- Bremer, A. A. Polycystic ovary syndrome in the pediatric population. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).
- Dunaif, A., et al. Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).
- Højlund, K., et al. Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment. Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).
- Moghetti, P., et al. Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).
- Ovalle, F., Azziz, R. Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus. Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).
- Dunaif, A., et al. Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome. Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).
- Hutchison, S. K., et al. Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).
- Stepto, N. K., et al. Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp. Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).
- Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with "mild" and "severe" type 2 diabetes. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).
- Blesson, C. S., et al. Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats. Frontiers in Endocrinology. 10, 538 (2019).
- Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
- Chappell, N. R., et al. Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes. Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).
- Chacko, S. K., et al. Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide. Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).
- Bier, D. M., et al. Measurement of "true" glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose. Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).
- Chacko, S. K., Sunehag, A. L. Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).
- Chacko, S. K., et al. Effect of ghrelin on glucose regulation in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice. Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).
- Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. In vivo urea kinetic studies in conscious mice. The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).
- Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. How to measure hepatic insulin resistance. Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).
