Avaliação da Produção de Glicose Hepática em um Modelo de Rato da Síndrome do Ovário Policístico

Summary

Este estudo descreve a medição direta da produção de glicose hepática em um modelo de rato com síndrome do ovário policístico usando um rastreador de glicose isotópico estável via veia da cauda em estados ricos em jejum e glicose em conjunto.

Abstract

A síndrome do ovário policístico (SPC) é uma doença comum que resulta em distúrbios do metabolismo da glicose, como resistência à insulina e intolerância à glicose. O metabolismo de glicose disregulado é uma manifestação importante da doença e é a chave para sua patogênese. Portanto, estudos envolvendo avaliação do metabolismo da glicose no PCOS são de extrema importância. Pouquíssimos estudos quantificaram a produção de glicose hepática diretamente nos modelos PCOS usando rastreadores de glicose não radioativos. Neste estudo, discutimos instruções passo a passo para a quantificação da taxa de produção de glicose hepática em um modelo de camundongo PCOS medindo o enriquecimento M+2 da glicose de [6,6-2H2], um rastreador de glicose isotópico estável, via cromatografia a gás – espectrometria de massa (GCMS). Este procedimento envolve a criação de uma solução estável de rastreador de glicose isotópica, o uso da colocação do cateter da veia da cauda e a infusão do rastreador de glicose em estados ricos em jejum e glicose no mesmo camundongo em conjunto. O enriquecimento da glicose [_6,6-2H2]é medido utilizando-se derivado de pentaacetato em GCMS. Esta técnica pode ser aplicada a uma grande variedade de estudos envolvendo a medição direta da taxa de produção de glicose hepática.

Introduction

A síndrome do ovário policístico (SPC) é uma doença comum que ocorre em 12%-20% das mulheres em idade ^{reprodutiva1,2}. É uma doença complexa que resulta em fenótipos variáveis envolvendo ovários policísticos, menstruações irregulares e evidências clínicas ou laboratoriais de hiperandrogenemia, e é tipicamente diagnosticada quando uma mulher atende a dois dos três ^critérios3. Um aspecto predominante do SPC, e um fator-chave em sua patogênese, são os desarranjos metabólicos que são encontrados em mulheres que têm a doença. Mulheres com SPC têm maiores incidências de resistência à insulina, intolerância à glicose, obesidade e síndrome metabólica3,4,5,6. A resistência à insulina não é apenas uma manifestação da doença, mas acredita-se que contribua para sua patogênese, potencializando a ação do hormônio luteinizador no ovário, levando assim ao aumento da produção de androgênio7,8. Acredita-se que a resistência à insulina tenha várias origens possíveis, mas estudos sugerem que pode ser devido a padrões anormais de sinal do receptor de ^insulina9,10. Estudos avaliaram a resistência à insulina em pacientes com PCOS usando a técnica padrão-ouro do grampo hiperinsulinemico-euglicêmico11,12,13,14,15. Mulheres com SPC, independentemente do IMC, têm níveis mais elevados de resistência à insulina em comparação com os controles. O controle de insulina sobre a produção de glicose é prejudicado em distúrbios da resistência à insulina levando ao excesso de produção de glicose. Por exemplo, pacientes diabéticos têm aumentado as taxas de gliconeogênese e supressão prejudicada da glicogenólise16. Além disso, a supressão prejudicada da produção de glicose tem sido observada em ratos ^{diabéticos17}. Embora os estudos de grampo possam dar uma medida de resistência à insulina, poucos estudos no PCOS se concentram na medição direta da produção de glicose em estados em jejum e alimentados. Isso requer o uso de uma infusão isotópica de glicose não radioativa e medição através de espectrometria de massa.

Modelos animais têm sido amplamente utilizados em pesquisas de PCOS. Ambos os modelos de murina PCOS magra e obesa foram criados através da administração de andrógenos pré-natais, prepubertalmente ou pós-pubertally18. Os modelos de PCOS de roedores também demonstram diferenças metabólicas em comparação com seus respectivos controles. Dados anteriores do nosso laboratório demonstraram testes anormais de tolerância à glicose (GTT) em modelos de mouse PCOS (magros e obesos), consistentes com a literatura humana de ^PCOS19. O uso de um modelo animal magro e obeso permite uma investigação mais aprofundada sobre diferenças metabólicas. Especificamente, este modelo permite a avaliação da taxa de produção de glicose diretamente usando rastreadores de glicose isotópicas. Um dos rastreadores de glicose isotópica estáveis mais usados é a glicose [_6,6-2H2]. O enriquecimento de glicose [_6,6-2H2] pode ser medido usando um derivado de pentaacetato como descrito ^{anteriormente20}.

Neste estudo, nosso objetivo foi medir a taxa de produção de glicose hepática em jejum e estado rico em glicose em camundongos PCOS usando infusão de glicose isotópica. Essas técnicas podem ser aplicadas a uma ampla gama de experimentos envolvendo cinética de glicose.

Protocol

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina baylor. 1. Preparação de [6,6-2H2]glicose Um dia antes do procedimento, prepare o rastreador de glicose isótopo estável em soro fisiológico normal. Para este experimento, a glicose [6,6-2H2] foi usada como rastreador para medir a taxa de aparência da glicose plasmática.NOTA: Nest…

Representative Results

Utilizando equações de diluição de isótopos descritas anteriormente, a taxa total de glicose plasmática (glucoseRa) foi calculada a partir do enriquecimento M+2 de [6,6-2H2]glicose em condições de jejum e glicose rica usando o derivado pentaacetato21. Em condições de estado estável, presume-se que a taxa de aparecimento de glicose seja igual à taxa de desaparecimento da glicose. No grupo controle, a glicose total foi de 19,98 ± 2,53 mg/(kg·…

Discussion

Hiperglicemia e metabolismo de glicose anormal/homeostase são características do PCOS. O nível de glicose no sangue é mantido por uma combinação de glicose da dieta e produção de glicose através da glicogenólise e da gliconeogênese e glicogênese, sob o controle de hormônios e enzimas. A produção de glicose hepática é suprimida pela presença de aumento dos níveis de glicose circulante. Em desordens do metabolismo anormal da glicose, a regulação da supressão da produção de glicose está com…

Materials

0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion