Polikistik Over Sendromu Fare Modelinde Hepatik Glikoz Üretiminin Değerlendirilmesi
Summary
Bu çalışma, polikistik over sendromu fare modelinde hepatik glikoz üretiminin hem oruç hem de glikoz bakımından zengin durumlarda kuyruk damarı yoluyla stabil bir izotopik glikoz izleyici kullanılarak doğrudan ölçülen ölçümünü açıklar.
Abstract
Polikistik over sendromu (PKOS), insülin direnci ve glikoz intoleransı gibi glikoz metabolizması bozuklukları ile sonuçlanan yaygın bir hastalıktır. Düzensiz glikoz metabolizması hastalığın önemli bir tezahürüdür ve patogenezinin anahtarıdır. Bu nedenle PKOS’ta glikoz metabolizmasının değerlendirilmesini içeren çalışmalar son derece önemlidir. Çok az çalışma radyoaktif olmayan glikoz izleyiciler kullanarak doğrudan PKOS modellerinde hepatik glikoz üretimini ölçtü. Bu çalışmada, gaz kromatografisi – kütle spektrometresi (GCMS) aracılığıyla kararlı bir izotopik glikoz izleyicisi olan M+2 zenginleştirmesini ölçerek bir PKOS fare modelinde hepatik glikoz üretim oranının ölçülmesi için adım adım talimatları tartışıyoruz. Bu prosedür, stabil izotopik glukoz izleyici çözeltisinin oluşturulmasını, kuyruk damar kateteri yerleşiminin kullanılmasını ve aynı farede hem oruç hem de glikoz bakımından zengin durumlarda glikoz izleyicinin infüzyonunu içerir. [6,6-2H2]glikozun zenginleştirilmesi GCMS’de pentaasetat türevi kullanılarak ölçülür. Bu teknik, hepatik glikoz üretim oranının doğrudan ölçülünü içeren çok çeşitli çalışmalara uygulanabilir.
Introduction
Polikistik over sendromu (PKOS), üreme çağındaki kadınların %12-20’sinde görülen yaygın bir hastalıktır1,2. Polikistik overler, düzensiz mensesler ve hiperandrogenemi klinik veya laboratuvar kanıtlarını içeren değişken fenotiplerle sonuçlanan karmaşık bir hastalıktır ve tipik olarak bir kadın üç kriterden ikisini karşıladığında teşhis edilir3. PKOS’un baskın bir yönü ve patogenezinde önemli bir faktör, hastalığı olan kadınlarda bulunan metabolik dengesizliklerdir. PKOS’li kadınlarda insülin direnci, glikoz intoleransı, obezite ve metabolik sendrom görülme sıklığı daha yüksektir3,4,5,6. İnsülin direnci sadece hastalığın bir tezahürü değildir, aynı zamanda yumurtalıktaki luteinize edici hormonun etkisini etkileyerek patogenezine katkıda bulunduğu ve böylece androjen üretiminin artmasına yol açtığı düşünülmektedir7,8. İnsülin direncinin birkaç olası kökene sahip olduğu düşünülmektedir, ancak çalışmalar bunun anormal insülin reseptör sinyalleri örüntülerinden kaynaklanabileceğini göstermektedir9,10. Çalışmalar, hiperinsülinemik-ögllikemik kelepçenin altın standart tekniğini kullanarak PKOS hastalarında insülin direncini değerlendirmiş11,12,13,14,15. VKİ’den bağımsız olarak PKOS’lu kadınlar, kontrollere kıyasla daha yüksek insülin direnci seviyelerine sahiptir. Aşırı glikoz üretimine yol açan insülin direnci bozukluklarında glikoz üretimi üzerinde insülin kontrolü bozulur. Örneğin, diyabetik hastalarda glukogenez oranları artmış ve glikojenoliz baskılanması bozulmuş16. Ayrıca diyabetik sıçanlarda glikoz üretiminin baskılanmasında bozulma gözlenmiştir17. Kelepçe çalışmaları insülin direnci ölçümü verebilse de, PKOS’ta çok az çalışma oruç ve beslenen durumlarda glikoz üretiminin doğrudan ölçümüne odaklanmaktadır. Bu, radyoaktif olmayan izotopik glukoz izleyici infüzyonu ve kütle spektrometresi yoluyla ölçüm kullanılmasını gerektirir.
Hayvan modelleri PKOS araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Hem yağsız hem de obez tipi PKOS murine modelleri androjenlerin prenatal, prepubertal veya post-ergenlik döneminden sonra uygulanmasıyla oluşturulmuştur18. Kemirgen PKOS modelleri de ilgili kontrollerine kıyasla metabolik farklılıklar gösterir. Laboratuvarımızdan elde edilen önceki veriler, PCOS fare modellerinde (yalın ve obez) insan PKOS literatürü ile uyumlu anormal glikoz tolerans testleri (GTT) göstermiştir19. Yalın ve obez bir hayvan modelinin kullanılması metabolik farklılıkların daha fazla araştırılmasını sağlar. Özellikle, bu model doğrudan izotopik glikoz izleyicileri kullanılarak glikoz üretim oranının değerlendirilmesine izin verir. En sık kullanılan stabil izotopik glukoz izleyicilerinden biri [6,6-2H2]glikozdur. [6,6-2H2]glikoz zenginleştirme, daha önce açıklandığı gibi bir pentaasetat türevi kullanılarak ölçülebilir20.
Bu çalışmada amacımız izotopik glikoz infüzyonu kullanarak PKOS farelerinde oruç ve glikoz bakımından zengin durumda hepatik glikoz üretim oranını ölçmekti. Bu teknikler glikoz kinetiği içeren çok çeşitli deneylere uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hiperglisemi ve anormal glikoz metabolizması/homeostaz PKOS’un özellikleridir. Kan şekeri seviyesi, hormon ve enzimlerin kontrolü altında glikogenoliz ve glukogenez ve glikogenez yoluyla diyet ve glikoz üretiminden elde edilen glikozun bir kombinasyonu ile korunur. Hepatik glikoz üretimi, dolaşımdaki glikoz seviyelerinin artmasıyla bastırılır. Anormal glikoz metabolizması bozukluklarında, glikoz üretiminin baskılanması düzenlemesi hiperglisemiye yol açan tehlikeye girer. Birçok çalışma bi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Baylor Tıp Fakültesi (ALG) Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı ve Ulusal Sağlık Enstitülerinden CSB, SC ve JM için R-01 araştırma hibesi (Grant # DK114689) tarafından eğitim hibeleri ile desteklendi.
Materials
| 0.9% sodium chloride solution | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | VWR | 75846-756 | Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution) |
| 1-inch clear transpore tape | 3M | 70200400169 | |
| 1-inch Labeling tape | Fisher | GS07F161BA | Brand is example |
| 5 mL syringe containing heparanized saline flush | McKesson | 191-MIH-2235 | One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride) |
| 5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm if animal is between 2 and 6 months |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Advanced hot plate stirrer | VWR | 97042-602 | Brand is example |
| BD 27 gauge 0.5 inch needles | Health Warehouse | A283952 | |
| BD 30 gauge 0.5 inch needles | Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| Beaker, 1000 mL | Any brand | ||
| Caging pellets | |||
| Clear VOA glass vials with closed-top cap | Fisher Scientific | 05-719-120 | For storage of acetone and blood draw samples |
| Copper toothless alligator clamp for tourniquet | Amazon | Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper | |
| D-(+)-glucose >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-glucose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
| Magnifying glass | Amazon | Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand | |
| Microbalance | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Any similar model with 0.0001g accuracy can be used |
| Nalgene bottle, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom |
| PHD Ultra multi-syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
| Plexiglass sheet | Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion | ||
| Plexiglass sheets and dividers | Any brand; used to cage mice during infusion |
Referenzen
- March, W. A., et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria. Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).
- Yildiz, B. O., et al. Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria. Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).
- . Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).
- Goodarzi, M. O., et al. Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis. Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).
- Azziz, R. Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).
- Baskind, N. E., Balen, A. H. Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome. Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).
- Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).
- Bremer, A. A. Polycystic ovary syndrome in the pediatric population. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).
- Dunaif, A., et al. Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).
- Højlund, K., et al. Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment. Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).
- Moghetti, P., et al. Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).
- Ovalle, F., Azziz, R. Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus. Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).
- Dunaif, A., et al. Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome. Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).
- Hutchison, S. K., et al. Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).
- Stepto, N. K., et al. Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp. Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).
- Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with "mild" and "severe" type 2 diabetes. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).
- Blesson, C. S., et al. Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats. Frontiers in Endocrinology. 10, 538 (2019).
- Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
- Chappell, N. R., et al. Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes. Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).
- Chacko, S. K., et al. Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide. Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).
- Bier, D. M., et al. Measurement of "true" glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose. Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).
- Chacko, S. K., Sunehag, A. L. Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).
- Chacko, S. K., et al. Effect of ghrelin on glucose regulation in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice. Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).
- Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. In vivo urea kinetic studies in conscious mice. The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).
- Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. How to measure hepatic insulin resistance. Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).
