הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

Summary

מחקר זה מתאר את המדידה הישירה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי באמצעות מעקב גלוקוז איזוטופי יציב באמצעות וריד הזנב הן בצום והן במצבים עשירים בגלוקוז יחד.

Abstract

תסמונת השחלות הפוליצסטיות (PCOS) היא מחלה נפוצה המביאה להפרעות בחילוף החומרים של גלוקוז, כגון עמידות לאינסולין ואי סבילות לגלוקוז. חילוף החומרים של גלוקוז Dysregulated הוא ביטוי חשוב של המחלה והוא המפתח לפתוגנזה שלה. לכן, מחקרים מעורבים הערכה של חילוף החומרים גלוקוז ב- PCOS הם בעלי חשיבות עליונה. מעט מאוד מחקרים כימתו את ייצור הגלוקוז בכבד ישירות בדגמי PCOS באמצעות מעקבים לא רדיואקטיביים של גלוקוז. במחקר זה, אנו דנים בהוראות שלב אחר שלב לכימות קצב ייצור הגלוקוז בכבד במודל עכבר PCOS על ידי מדידת העשרה M+2 של [6,6-2H2]גלוקוז, מעקב גלוקוז איזוטופי יציב, באמצעות כרומטוגרפיה של גז – ספקטרומטריית מסה (GCMS). הליך זה כרוך ביצירת פתרון מעקב איזוטופי יציב, שימוש במיקום צנתר וריד הזנב ועירוי של נותב הגלוקוז הן בצום והן במצבים עשירים בגלוקוז באותו עכבר במקביל. ההעשרה של [6,6-2H2]] גלוקוז נמדדת באמצעות נגזרת פנטאצטאט ב- GCMS. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מחקרים מעורבים מדידה ישירה של קצב ייצור הגלוקוז בכבד.

Introduction

תסמונת השחלות הפוציסטיות (PCOS) היא הפרעה נפוצה המתרחשת ב 12%-20% של נשים בגיל ^{הרבייה1,2}. זוהי מחלה מורכבת וכתוצאה מכך פנוטיפים משתנים מעורבים שחלות פוליציסטיות, menses לא סדיר וראיות קליניות או מעבדה של hyperandrogenemia, והוא מאובחן בדרך כלל כאשר אישה עומדת בשניים משלושת ^{הקריטריונים3}. היבט דומיננטי של PCOS, וגורם מפתח בפתוגנזה שלה, הוא דעים מטבוליים שנמצאים אצל נשים שיש להם את המחלה. נשים עם PCOS יש שכיחות גבוהה יותר של תנגודת לאינסולין, אי סבילות לגלוקוז, השמנת יתר, תסמונת מטבולית3,4,5,6. תנגודת לאינסולין היא לא רק ביטוי של המחלה, אבל הוא חשב לתרום פתוגנזה שלה על ידי potentiating הפעולה של הורמון תחליב בשחלה ובכך מוביל ייצור אנדרוגן ^{מוגבר7,8}. תנגודת לאינסולין נחשבת יש מספר מקורות אפשריים אבל מחקרים מראים שזה יכול להיות בגלל דפוסים חריגים של קולטן אינסולין ^{איתות9,10}. מחקרים העריכו עמידות לאינסולין בחולי PCOS באמצעות טכניקת הזהב הסטנדרטית של מלחציים היפראינסולנמיים-אוגליקמיים11,12,13,14,15. לנשים עם PCOS, ללא קשר ל- BMI, יש רמות גבוהות יותר של תנגודת לאינסולין בהשוואה לבקרות. בקרת אינסולין על ייצור גלוקוז נפגעת בהפרעות של תנגודת לאינסולין המובילה לייצור עודף גלוקוז. לדוגמה, חולי סוכרת יש שיעורים מוגברים של gluconeogenesis ודיכוי לקוי של גליקוגנוליזה16. יתר על כן, דיכוי לקוי של ייצור גלוקוז נצפתה בחולדות ^סוכרת17. למרות שמחקרים מהדקים יכולים לתת מדידה של תנגודת לאינסולין, מחקרים מעטים ב- PCOS מתמקדים במדידה ישירה של ייצור גלוקוז במדינות צום ומזון. זה דורש שימוש עירוי מעקב איזוטופי איזוטופי לא רדיואקטיבי ומדידה באמצעות ספקטרומטריית מסה.

דגמים של בעלי חיים שימשו בהרחבה במחקר PCOS. מודלים מוריניים PCOS רזה והשמנת יתר נוצרו על ידי מתן אנדרוגנים לפני ההפלגה, prepubertally, או לאחר ^pubertally18. דגמי PCOS מכרסמים מדגימים גם הבדלים מטבוליים בהשוואה לבקרות שלהם. נתונים קודמים מהמעבדה שלנו הדגימו בדיקות סובלנות גלוקוז חריגות (GTT) בדגמי עכבר PCOS (רזה והשמנת יתר), העולים בקנה אחד עם ספרות PCOS ^{אנושית19}. שימוש במודל בעלי חיים רזה והשמנת יתר מאפשר חקירה נוספת של הבדלים מטבוליים. באופן ספציפי, מודל זה מאפשר הערכה של קצב ייצור הגלוקוז ישירות באמצעות מעקב גלוקוז איזוטופי. אחד ממעקב הגלוקוז האיזוטופי היציב הנפוץ ביותר הוא [6,6-2H2]גלוקוז. ניתן למדוד את העשרת הגלוקוז [^6,6-2H2]באמצעות נגזרת פנטאצטאט כפי שתואר קודם ^לכן20.

במחקר זה, המטרה שלנו הייתה למדוד את קצב ייצור הגלוקוז בכבד בצום ובמצב עשיר בגלוקוז בעכברים PCOS באמצעות עירוי גלוקוז איזוטופי. טכניקות אלה ניתן ליישם על מגוון רחב של ניסויים מעורבים קינטיקה גלוקוז.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של מכללת ביילור לרפואה. 1. הכנת [6,6-2H2]גלוקוז יום אחד לפני ההליך, להכין את מאתר גלוקוז איזוטופ יציב מלוחים רגילים. בניסוי זה, [6,6-2H2]גלוקוז שימש כמעקב למדידת קצב …

Representative Results

באמצעות משוואות דילול איזוטופ שתוארו בעבר, שיעור הגלוקוז הכולל בפלזמה (גלוקוזRa) חושב מהעשרה M+2 של [6,6-2H2]גלוקוז בתנאי צום וגלוקוז עשירים בגלוקוז באמצעות נגזרת המחומש21. בתנאים יציבים, ההנחה היא כי שיעור המראה של גלוקוז שווה לקצב היעלמות הגלוקוז. בקבוצת הביקורת,…

Discussion

היפרגליקמיה ומטבוליזם גלוקוז חריג/הומאוסטזיס הם תכונות של PCOS. רמת הגלוקוז בדם נשמרת על ידי שילוב של גלוקוז מתזונה וייצור גלוקוז באמצעות גליקוגנוליזה וגלוקונוגנזה וגליקוגנזה, בשליטת הורמון ואנזימים. ייצור גלוקוז בכבד מדוכא על ידי נוכחות של רמות גלוקוז במחזור מוגבר. בהפרעות של חילוף …

Materials

0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion