Valutazione della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico

Summary

Questo studio descrive la misurazione diretta della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell’ovaio policistico utilizzando un tracciante di glucosio isotopico stabile attraverso la vena della coda sia a digiuno che in stati ricchi di glucosio in tandem.

Abstract

La sindrome dell’ovaio policistico (PCOS) è una malattia comune che provoca disturbi del metabolismo del glucosio, come l’insulino-resistenza e l’intolleranza al glucosio. Il metabolismo disregolato del glucosio è una manifestazione importante della malattia ed è la chiave della sua patogenesi. Pertanto, gli studi che coinvolgono la valutazione del metabolismo del glucosio nella PCOS sono della massima importanza. Pochissimi studi hanno quantificato la produzione di glucosio epatico direttamente in modelli PCOS utilizzando traccianti di glucosio non radioattivi. In questo studio, discutiamo le istruzioni passo-passo per la quantificazione del tasso di produzione di glucosio epatico in un modello murino PCOS misurando l’arricchimento M + 2 di [6,6-2H2] glucosio, un tracciante isotopico stabile del glucosio, tramite gascromatografia – spettrometria di massa (GCMS). Questa procedura prevede la creazione di una soluzione stabile di tracciante isotopico del glucosio, l’uso del posizionamento del catetere della vena della coda e l’infusione del tracciante del glucosio sia a digiuno che ricchi di glucosio nello stesso topo in tandem. L’arricchimento del glucosio [_6,6-2H2] viene misurato utilizzando il derivato del pentaacetato in GCMS. Questa tecnica può essere applicata a un’ampia varietà di studi che coinvolgono la misurazione diretta del tasso di produzione epatica di glucosio.

Introduction

La sindrome dell’ovaio policistico (PCOS) è una malattia comune che si verifica nel 12%-20% delle donne in età ^{riproduttiva1,2}. È una malattia complessa che provoca fenotipi variabili che coinvolgono ovaie policistiche, mestruazioni irregolari e prove cliniche o di laboratorio di iperandrogenemia, e viene tipicamente diagnosticata quando una donna soddisfa due dei tre ^criteri3. Un aspetto predominante della PCOS, e un fattore chiave nella sua patogenesi, sono gli squilibri metabolici che si trovano nelle donne che hanno la malattia. Le donne con PCOS hanno una maggiore incidenza di insulino-resistenza, intolleranza al glucosio, obesità e sindrome ^{metabolica3,4,5,6}. La resistenza all’insulina non è solo una manifestazione della malattia, ma si pensa che contribuisca alla sua patogenesi potenziando l’azione dell’ormone luteinizzante nell’ovaio portando così ad un aumento della produzione di ^androgeni7,8. Si ritiene che la resistenza all’insulina abbia diverse possibili origini, ma gli studi suggeriscono che potrebbe essere dovuta a modelli anormali di segnalazione del recettore dell’insulina9,10. Gli studi hanno valutato la resistenza all’insulina nei pazienti con PCOS utilizzando la tecnica gold standard del morsetto iperinsulinemico-euglicemico11,12,13,14,15. Le donne con PCOS, indipendentemente dal BMI, hanno livelli più elevati di insulino-resistenza rispetto ai controlli. Il controllo dell’insulina sulla produzione di glucosio è compromesso nei disturbi della resistenza all’insulina che portano alla produzione eccessiva di glucosio. Ad esempio, i pazienti diabetici hanno un aumento dei tassi di gluconeogenesi e una ridotta soppressione della glicogenolisi16. Inoltre, è stata osservata una ridotta soppressione della produzione di glucosio nei ratti ^diabetici17. Sebbene gli studi sui morsetti possano fornire una misurazione della resistenza all’insulina, pochi studi sulla PCOS si concentrano sulla misurazione diretta della produzione di glucosio negli stati di digiuno e alimentazione. Ciò richiede l’uso di un’infusione di traccianti di glucosio isotopico non radioattivo e la misurazione tramite spettrometria di massa.

I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca sulla PCOS. Sia i modelli murini di PCOS magri che quelli obesi sono stati creati somministrando androgeni prenatale, prepubertale o post-puberale18. I modelli di PCOS dei roditori dimostrano anche differenze metaboliche rispetto ai rispettivi controlli. Dati precedenti del nostro laboratorio hanno dimostrato test di tolleranza al glucosio anormali (GTT) in modelli murini PCOS (magri e obesi), coerenti con la letteratura PCOS ^umana19. L’uso di un modello animale magro e obeso consente ulteriori indagini sulle differenze metaboliche. Nello specifico, questo modello consente di valutare il tasso di produzione di glucosio direttamente utilizzando traccianti isotopici del glucosio. Uno dei traccianti isotopici del glucosio stabile più comunemente usato è il glucosio [_6,6-2H2]. L’arricchimento del glucosio [_6,6-2H2] può essere misurato utilizzando un derivato del pentaacetato come descritto in ^precedenza20.

In questo studio, il nostro obiettivo era misurare il tasso di produzione di glucosio epatico a digiuno e allo stato ricco di glucosio nei topi PCOS utilizzando l’infusione isotopica di glucosio. Queste tecniche possono essere applicate a una vasta gamma di esperimenti che coinvolgono la cinetica del glucosio.

Protocol

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine. 1. Preparazione di [6,6-2H2]glucosio Un giorno prima della procedura, preparare il tracciante di glucosio isotopico stabile in soluzione salina normale. Per questo esperimento, il glucosio [6,6-2H2] è stato usato come tracciante per misurare il tasso di comparsa del glucosio plasmatico….

Representative Results

Utilizzando equazioni di diluizione isotopica precedentemente descritte, il tasso di glucosio plasmatico totale (glucoseRa) è stato calcolato dall’arricchimento M+2 di [6,6-2H2]glucosio in condizioni di digiuno e ricche di glucosio utilizzando il derivato pentaacetato21. In condizioni di stato stazionario, si presume che il tasso di comparsa del glucosio sia uguale al tasso di scomparsa del glucosio. Nel gruppo di controllo, il glugerba totale è stato …

Discussion

L’iperglicemia e il metabolismo anormale del glucosio / omeostasi sono caratteristiche della PCOS. Il livello di glucosio nel sangue è mantenuto da una combinazione di glucosio dalla dieta e produzione di glucosio attraverso la glicogenolisi e la gluconeogenesi e la glicogenesi, sotto il controllo di ormoni ed enzimi. La produzione epatica di glucosio è soppressa dalla presenza di un aumento dei livelli di glucosio circolante. Nei disturbi del metabolismo anormale del glucosio, la regolazione della soppression…

Materials

0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion