Identificatie van metabool actieve bacteriën in de darm van de Generalist<em> Spodoptera littoralis</em> Via DNA Stabiele Isotopen Onderzoek naar gebruik van<sup> 13</sup> C-Glucose
Summary
De actieve bacteriegemeenschappen geassocieerd met de darm van Spodoptera littoralis, werd bepaald door stabiele-isotoop probing (SIP) gekoppeld pyrosequencing. Met behulp van deze methodiek, de identificatie van de metabolisch actieve bacteriën soorten binnen de gemeenschap werd gedaan met een hoge resolutie en nauwkeurigheid.
Abstract
Ingewanden van de meeste insecten worden bewoond door complexe gemeenschappen van symbiotische pathogene bacteriën. Binnen deze microbiële gemeenschappen is het mogelijk om commensale of mutualistic bacteriesoorten identificeren. Deze laatste zijn waargenomen meerdere functies dienen om de insecten, dus helpen in insectencellen voortplanting 1, stimuleren van de immuunrespons 2, feromoonproductie 3, alsmede voeding, waaronder de synthese van essentiële aminozuren 4, onder anderen.
Vanwege het belang van deze associaties zijn veel pogingen gedaan om de gemeenschappen karakteriseren tot de afzonderlijke leden. De meeste van deze pogingen waren ofwel gebaseerd op teeltwijze of gebaseerd op de generatie van 16S rRNA genfragmenten die werden gesequenced voor definitieve identificatie. Helaas zijn deze benaderingen alleen die de bacteriële soorten in de darm en ontvangen geen information op de metabole activiteit van de micro-organismen.
Om de metabool actieve bacteriële species kenmerken in de darm van insecten, gebruikten we stabiele isotoop sonderen (SIP) in vivo toepassing van 13C-glucose als universeel substraat. Dit is een veelbelovende-cultuur vrije techniek die de koppeling van microbiële fylogenieën maakt het mogelijk om hun specifieke metabole activiteit. Dit is mogelijk door het volgen van stabiele isotoop gemerkte atomen substraten in microbiële biomarkers, zoals DNA en RNA 5. De opname van 13C isotopen in DNA verhoogt de dichtheid van de gemerkte DNA vergeleken met het ongelabelde (12 C) een. Uiteindelijk wordt het 13C-gelabelde DNA of RNA gescheiden door dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie van 12 C-ongelabelde soortgelijk 6. Daaropvolgende moleculaire analyse van de gescheiden nucleïnezuur isotopomeren zorgt voor de verbinding tussen metabole activiteit en identiteit van de soort.
Hier presenteren we het protocol dat wordt gebruikt om de metabolisch actieve bacteriën te karakteriseren in de darm van een generalist insect (ons model systeem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). De fylogenetische analyse van het DNA werd gedaan met behulp pyrosequentiebepaling, waardoor hoge resolutie en nauwkeurigheid bij de identificatie van insectendarm bacteriegemeenschappen. Als voornaamste substraat werd 13C-gelabelde glucose gebruikt in de experimenten. Het substraat werd toegevoerd aan de insecten met een kunstmatig dieet.
Introduction
Insect-bacteriële symbiotische associaties staan bekend om een groot aantal insectensoorten 7. In deze symbiotische associaties, micro-organismen spelen een belangrijke rol bij de groei en ontwikkeling van insecten. Microben is aangetoond bijdragen aan insecten voortplanting 1, feromoon biosynthese 3, voeding, waaronder de synthese van essentiële aminozuren 4 en vertering van voedsel ontoegankelijk voor de gastheer. Ondanks de grote verscheidenheid van darm-bacteriële verenigingen, veel minder bekend over de functionele rol die zij spelen in het voordeel van het insect. Alleen bij de termieten, de symbiotische vertering van lignocellulose door prokaryoten, protozoa en fungi uitgevoerd uitgebreid bestudeerd werd 8,9. In tegenstelling tot deze, is er weinig bekend over de symbiotische vereniging aanwezig in de darmen van generalist insecten, dwz de katoen leafworm, Spodoptera litteralis. Bovendien, omdat zij frequent verschuiving van plantaardige gastheren, algemeenist insecten en hun darm geassocieerde bacteriële gemeenschappen zijn permanent blootgesteld aan nieuwe uitdagingen in verband met hun voedingsgewoonten consumeren planten met een overvloed aan fytochemicaliën. Naast deze, de darm milieu lepidopterans, vormt op zich een ruwe omgeving voor de groei van bacteriën vanwege de hoge darm pH 10. Vooral bij S. littoralis, varieert van 10,5 in de foregut, ca. 9 in de middendarm bijna 7 in de dikke darm 11 pH. Anderzijds, de bacteriegemeenschappen verband met de darm van S. littoralis is eenvoudig. Tang, Freitak, et al.. 12 rapporteerde maximaal 36 phylotypes behoren tot totaal 7 verschillende bacteriële species als de enige leden van de bacteriële gemeenschap waaraan deze insecten. Daarnaast is geen ingewikkelde fokken procedure vereist voor de groei insect in het laboratorium. Bovendien, deze en de korte levenscyclus van het insect te vergemakkelijken multi-generational studies, het draaien van deze soort tot een ideaal modelsysteem voor het bestuderen gut-microbe interacties.
Met de komst van PCR-gebaseerde sequencing technologie, is het aantal studies behandeling van darm biota van verscheidene organismen (bijvoorbeeld mensen, insecten of mariene organismen) verhoogd. Bovendien zal het resultaat zijn onafhankelijk van isolatie en kweek van de darm herbergden bacteriën in het verleden. Bijna 99% van de bacteriën zijn niet kweekbare en de simulatie van de milieu-omstandigheden in de darm is moeilijk 12. Door PCR kan 16S rRNA genfragmenten (een veelgebruikt fylogenetische merkergen onder bacteriën) selectief worden geamplificeerd uit een gemengde DNA-matrijs van darm bacteriële, gesequenced en gekloneerd. Met deze informatie, de gebruiker kan de bacteriële species te identificeren dan de sequentie informatie ophalen uit openbare databanken 13,14. Toch is de sequentie zal bacteriële beschrijvengemeenschappen onvoldoende blijven door gebrek aan informatie over de intrinsieke metabole bijdrage van de afzonderlijke soorten binnen de gemeenschap.
Stabiele isotoop sonderen (SIP) is een veelbelovende-cultuur free techniek. Het wordt vaak gebruikt in Environmental Microbiology microbiële fylogenie verband houden met bepaalde metabolische analyseert. Dit wordt bereikt door het volgen stabiele isotoop gemerkte atomen substraten in microbiële biomarkers, zoals fosfolipide afgeleide vetzuren, DNA en RNA 5. Bij het overwegen van nucleïnezuren, is de methode gebaseerd op de scheiding van 13C-gelabelde DNA of RNA van het ongelabelde DNA door dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie 6. Door deze directe verbinding tussen de DNA label en metabolische activiteit, een stroomafwaartse moleculaire analyse van de nucleïnezuren worden de soort en geeft informatie over metabolische activiteiten. Bovendien combinatie van DNA-SIP en pyrosequencing zoals toegepast doorPilloni, von Netzer, et al.. 15, maakt een bijzonder eenvoudige en gevoelige identificatie van de bacteriële soorten in de zware 13 C-gelabelde DNA-fractie. Tot nu toe is deze techniek toegepast om de bacteriële gemeenschappen die betrokken zijn bij biogeochemische processen in de bodem onder aerobe en anaerobe omstandigheden 16,17 18,19 beschrijven. Naast het gebruik in milieukunde wordt de techniek toegepast in de medische wetenschappen zoals beschreven door Reichardt, et al.. 5, die de metabolische activiteiten van verschillende fylogenetische groepen van de menselijke darmflora beschreven in reactie op een verteerbare koolhydraten.
Hier gebruiken we 13C-glucose om "label" het DNA van de metabool actieve bacteriële soorten in de darm. Glucose is een suiker die door de meeste bacteriële species langs de brede Entner-Doudoroff (ED) route, hoewel uitzonderingen bekend 20. Dezerechtvaardigt het gebruik van 13 C-glucose als een betrouwbare metabole sonde die een verband tussen metabolieten van belang en de bron koolstof langs gevestigde paden biedt. Afhankelijk van de wetenschappelijke vraag andere substraten, namelijk 13 C-methaan, 13 CO 2 of planten onder een 13 CO2 atmosfeer verhoogd, kan worden gebruikt voor metabolische activiteiten te pakken.
Op dit punt, presenteren wij het protocol toegepast in de metabole karakterisering van de darm bacteriële gemeenschap van een generalist insect, namelijk S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Bovendien werd de techniek gekoppeld aan pyrosequencing, die op zijn beurt maakt de identificatie van insectendarm bacteriegemeenschappen met hoge resolutie en precisie. Als belangrijkste substraat werd 13C-gelabelde glucose gebruikt tijdens de experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De darm van de meeste insecten herbergt een rijke en complexe microbiële gemeenschap, meestal 10 7 -10 9 prokaryote cellen dienen er een verhouding eigen cellen van de gastheer in de meeste gevallen. Zo is de insectendarm is een "hot spot" voor diverse microbiële activiteiten, die meerdere aspecten van microbiële relaties, van pathogenese naar mutualisme 27 obligaat. Hoewel veel studies een verbazingwekkende verscheidenheid aan insecten darm microbiële gemeenschappen, hebbe…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Angelika Berg voor laboratorium hulp. Dit werk werd ondersteund en gefinancierd door het Max Planck Instituut en de Jena School voor Microbiële Communication (JSMC).
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
Referencias
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A., VH, R. e. s. h., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution – a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
