Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista<em> Spodoptera littoralis</em> Via DNA Isótopos Estáveis Sondagem Usando<sup> 13</sup> C-Glicose
Summary
A comunidade bacteriana activa associada ao intestino de Spodoptera littoralis, foi determinada por-estável-sondagem isótopo (SIP) acoplado a pyrosequencing. Usando essa metodologia, a identificação das espécies de bactérias metabolicamente ativas dentro da comunidade foi feito com alta resolução e precisão.
Abstract
Guts da maioria dos insetos são habitadas por comunidades complexas de bactérias não patogênicas simbióticas. Dentro dessas comunidades microbianas é possível identificar comensais ou bactérias mutualistas espécie. Os últimos, têm sido observados para servir várias funções ao inseto, ou seja, ajudar na reprodução de insetos 1, aumentando a resposta imune 2, produção de feromônio 3, bem como a nutrição, incluindo a síntese de aminoácidos essenciais 4, entre outros.
Devido à importância dessas associações, foram feitos muitos esforços para caracterizar as comunidades de baixo para os membros individuais. No entanto, a maioria desses esforços foram ou baseados em métodos de cultivo ou contado com a geração de fragmentos de genes 16S rRNA que foram seqüenciados para a identificação final. Infelizmente, estas abordagens apenas identificadas as espécies de bactérias presentes no intestino e, desde que não informatião sobre a actividade metabólica dos microrganismos.
Para caracterizar a espécie de bactérias metabolicamente activas no intestino de um insecto, que utilizado isótopo estável sondagem (SIP) in vivo utilizando 13 C-glucose como um substrato universal. Esta é uma técnica de cultura livre de promissor que permite a ligação de Filogenias microbianas para a sua actividade metabólica específica. Isto é possível por rastreamento de isótopos estáveis, marcado átomos de substratos em biomarcadores microbianos, tais como o ADN e ARN 5. A incorporação de 13 C isótopos para DNA aumenta a densidade do ADN marcado em comparação com a não marcado (12 C) uma. No final, o ADN de 13 C-rotulado ou RNA é separado por ultracentrifugação de gradiente de densidade a partir de 12-C sem rótulo semelhante um 6. A análise molecular subsequente dos isotopómeros ácidos nucleicos separados proporciona a ligação entre a actividade metabólica e a identidade das espécies.
Aqui, apresentamos o protocolo usado para caracterizar as bactérias metabolicamente ativas no intestino de um inseto generalista (nosso sistema modelo), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). A análise filogenética do DNA foi feito utilizando pyrosequencing, o que permitiu alta resolução e precisão na identificação do intestino do insecto comunidade bacteriana. Como substrato principal, 13 C-glucose marcada foi utilizada nas experiências. O substrato foi alimentado aos insectos por meio de uma dieta artificial.
Introduction
Associações simbióticas Insect-bacterianos são conhecidos por um grande número de espécies de insetos 7. Nestas associações simbióticas, microrganismos desempenham um papel importante no crescimento e desenvolvimento de insectos. Os micróbios têm sido mostrados para contribuir para a reprodução de insectos 1, feromona biossíntese 3, nutrição, incluindo a síntese de aminoácidos essenciais, 4, e a digestão de alimentos inacessível ao hospedeiro. Apesar da grande variedade de associações gut-bacteriana, muito menos se sabe sobre o papel funcional que desempenham em favor do inseto. Só no caso de as térmitas, a digestão simbiótica de lignocelulose realizada por procariotas, protozoários e fungos, tem sido amplamente estudada 8,9. Em contraste com isso, pouco se sabe sobre a associação simbiótica presente no intestino dos insetos generalistas, ou seja, o curuquerê, Spodoptera littoralis. Além disso, devido à sua mudança freqüente de plantas hospedeiras, em geralist insetos e seus intestino comunidades bacterianas associadas estão permanentemente expostos a novos desafios vinculados a seus hábitos alimentares consumir plantas com uma infinidade de fitoquímicos. Ao lado desta, o ambiente do intestino em lepidópteros, representa por si só um ambiente hostil para o crescimento de bactérias por causa do elevado pH do intestino 10. Particularmente, no caso de S. littoralis, que varia de 10,5 no intestino anterior, ca. 9 no intestino médio para um pH de cerca de 7 no intestino posterior 11. Por outro lado, a comunidade bacteriana associada com o intestino de S. littoralis é simples. Tang, Freitak, et al. 12 relataram um máximo de 36 filotipos pertencentes a um total de 7 espécies de bactérias diferentes, como os únicos membros da comunidade bacteriana associada a esse inseto. Além disso, qualquer processo de criação complicado é necessário para o crescimento dos insectos no laboratório. Além disso, este e o curto ciclo de vida do insecto facilitar multi-gestudos enerational, transformando esta espécie em um sistema modelo ideal para o estudo de interações gut-micróbio.
Com o advento das tecnologias de seqüenciamento baseadas na PCR, o número de estudos que tratam de intestino biota de vários organismos (ou seja, os seres humanos, insetos, ou organismos marinhos) tem aumentado. Além disso, os resultados são independentes do isolamento e cultivo das bactérias intestinais abrigado como no passado. Quase 99% das bactérias não são cultiváveis e a simulação das condições ambientais prevalecentes no intestino é difícil 12. Usando PCR, os fragmentos de genes de rRNA 16S (um gene marcador filogenético amplamente utilizado entre as bactérias) pode ser amplificado de forma selectiva um molde de ADN mista de comunidades bacterianas do intestino, sequenciados, e clonado. Com essas informações, o usuário é capaz de identificar as espécies de bactérias depois de recuperar as informações da seqüência de bases de dados públicas 13,14. No entanto, a sequenciação de abordagens para descrever bacterianacomunidades continuam a ser insuficientes, devido à falta de informações sobre a contribuição metabólica intrínseca de cada espécie dentro da comunidade.
Stable-isótopo sondagem (SIP) é uma técnica sem cultura promissor. Ele é frequentemente usado em microbiologia ambiental para analisar filogenias microbianas associadas a determinadas atividades metabólicas. Isto é conseguido através do rastreamento de isótopos estáveis, marcado átomos de substratos em biomarcadores microbianos, tais como os ácidos gordos derivados de fosfolípidos, DNA e RNA de 5. Ao considerar os ácidos nucleicos, a metodologia baseia-se na separação de 13 de ADN marcado com C ou de ARN a partir do ADN não marcado por ultracentrifugação em gradiente de densidade de 6. Devido a esta ligação directa entre o marcador de ADN e actividade metabólica, uma análise molecular jusante dos ácidos nucleicos identificam as espécies e fornece informações sobre as actividades metabólicas. Além disso, a combinação de ADN-SIP e pyrosequencing como aplicado porPilloni, von Netzer, 15 et al., Permite uma identificação simples e sensível em particular da espécie bacteriana presente na 13 fracção pesada de ADN marcada com C. Até agora, esta técnica tem sido aplicada para descrever as comunidades bacterianas envolvidas em processos biogeoquímicos em solo sob aeróbicos e anaeróbicos condições 16,17 18,19. Além do uso em ciências ambientais, a técnica tem sido aplicada em ciências médicas como relatado por Reichardt, et al. 5, que descreveu as atividades metabólicas dos diferentes grupos filogenéticos da microbiota intestinal humana em resposta a um carboidrato digerível.
Aqui usamos 13 C-glucose em "rótulo" o ADN das espécies de bactérias metabolicamente activas no intestino. A glicose é um açúcar utilizado pela maioria das espécies bacterianas, ao longo da via generalizada Entner-Doudoroff (ED), embora excepções são conhecidas 20. Estejustifica o uso de 13 C-glicose como uma sonda metabólica confiável que fornece uma ligação entre metabólitos de interesse e a fonte de carbono ao longo de caminhos estabelecidos. Dependendo da causa científica, outros substratos, ou seja, 13 C-metano, 13 CO 2, ou plantas cultivadas sob uma atmosfera de 13 CO 2, podem ser usadas para tratar as actividades metabólicas.
Neste ponto, apresentamos o protocolo aplicado na caracterização metabólica da comunidade bacteriana do intestino de um inseto generalista, ou seja, S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Além disso, a técnica foi acoplada a pyrosequencing, que por sua vez permite a identificação da comunidade bacteriana do intestino de insectos, com alta resolução e precisão. Como o substrato principal, 13 C-glucose marcada foi utilizado durante os experimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O intestino da maioria dos insetos abriga uma comunidade microbiana rica e complexa, normalmente 10 7 -10 9 células procariotas apresentar lá, superando as próprias células do hospedeiro, na maioria dos casos. Assim, o inseto intestino é um "hot spot" para diversas atividades microbianas, representando vários aspectos das relações microbianas, de patogênese para obrigar mutualismo 27. Embora muitos estudos têm descrito uma incrível variedade de comunidades microbiana…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Angelika Berg de assistência laboratorial. Este trabalho foi apoiado e financiado pela Sociedade Max Planck e da Escola de Comunicação Jena microbiana (JSMC).
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
Referencias
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