ジェネラリストの腸内で代謝的に活性な細菌の同定<em>ハスモンヨトウリットラリス</em> DNAを安定同位体を経由して使用するプロービング<sup> 13</sup> C-グルコース
Summary
ハスモンヨトウのサキシマスオウノキの腸に関連するアクティブ細菌群集は、ピロシーケンスに結合された安定同位体プロービング（SIP）により決定した。この方法論を使用して、コミュニティ内の代謝的に活性な細菌種の同定は、高分解能かつ高精度に行った。
Abstract
ほとんどの昆虫の根性が共生非病原性細菌の複雑な共同体が生息している。そのような微生物群集内では、相利共生又は細菌種を同定することができる。後者のものは、特に必須アミノ酸4の合成を含む免疫応答2、フェロモン産3、ならびに栄養を、昇圧、 すなわち昆虫再生1に助け、昆虫に複数の機能を果たすことが観察されている。
により、これらの団体の重要性に、多くの努力が、個々のメンバーにまで社会を特徴づけるために行われてきた。しかしながら、これらの努力のほとんどは、いずれかの栽培方法に基づいて、または最終同定のために配列決定した16S rRNA遺伝子断片の生成に依拠した。残念ながら、これらのアプローチは、腸内に存在する細菌種を特定しないのinformatありません微生物の代謝活性へのイオン。
昆虫の腸内で代謝的に活性な細菌種を特徴づけるために、我々は、ユニバーサル基質として13 C-グルコースを用いたin vivoで （SIP）をプロービング安定同位体を使用した。これは彼らの特定の代謝活性のための微生物系統発生の連結を可能にする有望な文化のない手法である。これは、DNAやRNAなどの微生物のバイオマーカー5の中に基質から安定な同位体標識された炭素原子を追跡することが可能である。 13 Cの取り込みは、非標識（12 C）標識されたものと比較してDNAの濃度を増加させるDNAに同位。最後に、13 C-標識されたDNAまたはRNAは、12 C-標識されていない同様のものを6から密度勾配超遠心分離によって分離される。分離された核酸のアイソトポマーのその後の分析は、分子種の代謝活性とアイデンティティとの間の接続を提供する。
ここでは、ジェネラリスト昆虫（我々のモデル系）、 スポドプテラ·リトラリス （ 鱗翅目、ヤガ科 ）の腸内で代謝活性細菌を特徴づけるために使用されるプロトコルを提示する。 DNAの系統解析は、昆虫の腸内細菌集団の同定を高い分解能と精度を可能にピロシーケンスを使用して行った。メイン基板として、13 C-標識されたグルコースは、実験で使用した。基板は、人工飼料を使用して、昆虫に供給した。
Introduction
昆虫、細菌の共生アソシエーションは昆虫種7多数のために知られている。これらの共生協会では、微生物は、昆虫の成長と発展に重要な役割を果たしている。微生物は、必須アミノ酸4の合成、およびホストへアクセスできなく食物の消化を含む昆虫再生1、フェロモン生合成3、栄養に貢献することが示されている。腸の細菌団体の広大な様にもかかわらず、はるかに少ない彼らは昆虫の賛成で遊ぶ機能的役割についてはほとんど知られていない。シロアリのみの場合には、リグノセルロースの共生消化は、原核生物、原生動物、および真菌によって行う、8,9広く研究されている。これとは対照的に、少しはコットンリーフワーム、すなわち 、 ハスモンヨトウのサキシマスオウノキ。また、原因植物宿主の彼らの頻繁なシフトに、一般的なジェネラリスト昆虫の消化管に存在する共生関連についてはほとんど知られていないIST昆虫とその消化管関連細菌群集は永続的にその食性は植物化学物質の過多で植物を消費するにリンクされ、新たな課題にさらされている。この他に、鱗翅目における腸環境は、 それ自体が高いため、腸pH 10の細菌の増殖のための過酷な環境を表す。特にSの場合、 サキシマスオウノキ 、それはカリフォルニア 、前腸内の10.5の範囲である。腸内の9のpHにほぼ7後腸11。一方、細菌群集はSの腸に関連するサキシマスオウノキは簡単です。唐、Freitak ら 12は、この虫に関連する細菌群集の唯一のメンバーとして7種類の細菌種の合計に属する36系統型の最大値を報告した。この他にも、複雑な飼育手順は、実験室での昆虫成長のために必要ありません。さらに、この昆虫の短いライフサイクルは、マルチグラムを容易にするenerational研究、腸管微生物の相互作用を研究するための理想的なモデルシステムにこの種を回す。
PCRベースのシーケンシング技術の出現により、いくつかの生物（ すなわち 、人間、昆虫、または海洋生物）の腸の生物相を扱う多くの研究が増加している。また、結果は、従来のように腸保有菌の分離と栽培から独立しています。細菌のほぼ99％が耕作されず、腸内で優勢な環境条件のシミュレーションが12困難である。 PCRを用いて、16S rRNA遺伝子断片（細菌の間で広く使用される系統発生遺伝子マーカー）を選択的に、腸管細菌群集との混合DNA鋳型から増幅され、配列決定し、クローン化することができる。この情報により、ユーザは、公開データベース13,14からの配列情報を取得した後、細菌の種を同定することができる。それにもかかわらず、配列決定は、細菌を記述するために近づくコミュニティは、コミュニティ内の個々の種の本質的な代謝の貢献に関する情報の不足のために不十分なままです。
（SIP）をプロービング安定同位体は、有望な文化のない手法である。これは、しばしば特定の代謝活動にリンクされた微生物の系統発生を分析するために、環境微生物学で使用される。これは、リン脂質由来の脂肪酸、DNA、RNAおよび5のような微生物のバイオマーカーへの基材から、安定同位体標識された炭素原子を追跡することによって達成される。核酸を考慮すると、方法論は、密度勾配超遠心分離することにより、非標識DNA 6から13 C標識DNAまたはRNAの分離に基づいている。原因のDNAラベルと代謝活性の間のこの直接の接続に、核酸の下流分子解析は、種を識別し、代謝活動に関する情報を提供しています。さらに、DNA-SIP及びパイロシーケンシングの組み合わせによって適用されるPilloni、フォンNetzer ら 15は 、重い13 C標識DNA画分に存在する細菌種の特定の単純で敏感な同定を可能にする。これまで、この技術は、好気性および嫌気性条件下16,17 18,19の下で、土壌中の生物地球化学的プロセスに関与する細菌群集を記述するために適用されている。難消化性炭水化物に反応して、人間の腸内細菌叢の異なる系統発生のグループの代謝活動を説明しライハルトら 5によって報告されるように環境科学での使用のほかに、技術は医学に適用されている。
ここでは、「ラベル」に、腸内の代謝活性のある細菌種のDNAを13 C-グルコースを使用しています。グルコースは、例外が20知られているが、広範なエントナー·（ED）経路に沿ってほとんどの細菌種によって利用糖である。この関心と確立された経路に沿って炭素源の代謝物との間のリンクを提供して信頼性の代謝プローブとして13 C-グルコースの使用を正当化する。科学的な質問、他の基質、 すなわち 13 C-メタン、13 CO 2、又は13 CO 2雰囲気下で昇植物に依存して、代謝活性をアドレス指定するために使用することができる。
この時点で、我々はジェネラリスト昆虫の消化管細菌群集の代謝特性評価、すなわち、Sに適用されるプロトコルを提示サキシマスオウノキ （ 鱗翅目、ヤガ科 ）。さらに、技術が順番に高い分解能と精度で昆虫の腸細菌群集の同定を可能にするパイロシーケンシングに結合した。メイン基板として、13 C-標識されたグルコースは、実験中に使用した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ほとんどの昆虫の消化管は、豊かで複雑 な微生物群集を保有。通常、10 7 -10 9原核細胞は、ほとんどの場合、宿主自身の細胞をより多かっ、そこに留まる。このように、昆虫の腸は共生27を義務づけるための病因から、微生物関係のさまざまな側面を表現する、多様な微生物活動のための「ホットスポット」である。多くの研究が昆虫の腸の微生物コミュニティの…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、実験室での支援をアンジェリカベルクに感謝します。この作品は、マックスプランク協会および微生物コミュニケーション（JSMC）のためのイエナ大学によってサポートされ、融資された。
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
Referencias
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