Identification des bactéries métaboliquement actif dans l'intestin du généraliste<em> Spodoptera littoralis</em> Par ADN isotopes stables de palpage Utilisation<sup> 13</sup> C-Glucose
Summary
La communauté bactérienne active associée à l'intestin de Spodoptera, a été déterminée par des isotopes stables-sondage (SIP) couplé à pyroséquençage. En utilisant cette méthodologie, l'identification des espèces de bactéries métaboliquement actives au sein de la communauté a été fait avec une haute résolution et de précision.
Abstract
Entrailles de la plupart des insectes sont habitées par des communautés complexes de bactéries non pathogènes symbiotiques. Dans ces communautés microbiennes, il est possible d'identifier les espèces de bactéries commensales ou mutualistes. Ces derniers chers, ont été observées pour servir plusieurs fonctions à l'insecte, à savoir aider à une reproduction des insectes, en stimulant la réponse immunitaire 2, la production de phéromone 3, ainsi que la nutrition, y compris la synthèse des acides aminés essentiels 4, entre autres.
En raison de l'importance de ces associations, de nombreux efforts ont été réalisés pour caractériser les communautés vers le bas pour les membres individuels. Cependant, la plupart de ces efforts ont été soit basées sur des méthodes de culture ou invoqué la génération de fragments de gènes ARNr 16S qui ont été séquences pour l'identification finale. Malheureusement, ces approches ne identifié les espèces bactériennes présentes dans l'intestin et n'ont fourni aucune informations sur l'activité métabolique des micro-organismes.
Afin de caractériser l'espèce bactérienne métaboliquement actives dans l'intestin d'un insecte, on a utilisé des isotopes stables de palpage (SIP) in vivo employant 13 C-glucose comme substrat universel. Il s'agit d'une technique de culture libre-prometteuse qui permet la liaison de la phylogénie microbiennes à leur activité métabolique particulier. Cela est possible en suivant, isotopes stables marqué atomes de substrats en biomarqueurs microbiens, tels que l'ADN et de l'ARN 5. L'incorporation d'isotopes 13 C dans l'ADN augmente la densité de l'ADN marqué par rapport à la non marqué (12 C) une. En fin de compte, l'ADN marqué au 13 C ou de l'ARN est séparé par ultracentrifugation en gradient de densité à partir de la C-12 non marqué similaire une 6. Analyse moléculaire ultérieure des isotopomères d'acides nucléiques séparés assure la liaison entre l'activité métabolique et de l'identité de l'espèce.
Ici, nous présentons le protocole utilisé pour caractériser les bactéries métaboliquement actives dans l'intestin d'un insecte généraliste (notre système de modèle), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). L'analyse phylogénétique de l'ADN a été effectuée à l'aide pyroséquençage, ce qui a permis une haute résolution et une précision dans l'identification de la communauté bactérienne de l'intestin des insectes. Comme substrat principal, 13 C-glucose marqué a été utilisé dans les expériences. Le substrat a été introduit dans les insectes en utilisant un régime artificiel.
Introduction
Associations symbiotiques insectes bactériennes sont connus pour un grand nombre d'espèces d'insectes 7. Dans ces associations symbiotiques, les micro-organismes jouent un rôle important dans la croissance et le développement des insectes. Les microbes ont été montrés pour contribuer à une reproduction des insectes, des phéromones biosynthèse 3, de la nutrition, y compris la synthèse des acides aminés essentiels 4, et la digestion de la nourriture inaccessible à l'hôte. En dépit de la grande variété des associations intestinale bactérienne, on sait beaucoup moins sur le rôle fonctionnel qu'ils jouent en faveur de l'insecte. Seulement dans le cas des termites, la digestion symbiotique de la lignocellulose réalisé par les procaryotes, les protozoaires et les champignons, a été largement étudiée 8,9. Contrairement à cela, on sait peu sur l'association symbiotique présente dans l'intestin des insectes généralistes à savoir la noctuelle du coton Spodoptera littoralis. Par ailleurs, en raison de leur changement fréquent des plantes hôtes, généralist insectes et de leurs communautés bactériennes associées de l'intestin sont exposés en permanence à de nouveaux défis liés à leurs habitudes alimentaires consommant des plantes avec une pléthore de composés phytochimiques. A côté de cela, l'environnement de l'intestin dans les lépidoptères, représente en soi un environnement difficile pour la croissance des bactéries en raison de l'intestin pH élevé 10. En particulier dans le cas de S. littoralis, il varie de 10,5 dans l'intestin antérieur, ca. 9 dans l'intestin moyen de pH près de 7 dans l'intestin postérieur 11. D'autre part, la communauté bactérienne associée à l'intestin de S. littoralis est simple. Tang, Freitak, et al 12. Ont rapporté un maximum de 36 phylotypes appartenant à un total de 7 espèces bactériennes différentes que les seuls membres de la communauté bactérienne associée à cet insecte. En outre, aucune procédure d'élevage compliqué est nécessaire pour la croissance des insectes dans le laboratoire. En outre, ce et le cycle de vie court de l'insecte faciliter multi-gétudes enerational, tournant cette espèce dans un système de modèle idéal pour étudier les interactions intestin-microbe.
Avec l'avènement des technologies de séquençage basées sur la PCR, le nombre d'études traitant de l'intestin biote de plusieurs organismes (par exemple les humains, les insectes ou les organismes marins) a augmenté. De plus, les résultats sont indépendants de l'isolement et de culture des bactéries de l'intestin hébergé comme par le passé. Près de 99% des bactéries ne sont pas cultivables et la simulation des conditions environnementales régnant dans l'intestin est difficile 12. En utilisant la PCR, des fragments de gène d'ARNr 16S (un marqueur de gène phylogénétique largement utilisé chez les bactéries) peuvent être amplifiés de manière sélective à partir d'une matrice d'ADN mixte des communautés bactériennes intestinales, séquencées, et clones. Avec cette information, l'utilisateur est capable d'identifier les espèces bactériennes après avoir récupéré les informations de séquence à partir de bases de données publiques 13,14. Néanmoins, le séquençage des approches pour décrire bactériennecommunautés restent insuffisants en raison du manque d'informations sur la contribution métabolique intrinsèque de chacune des espèces au sein de la communauté.
Isotopes stables de sondage (SIP) est une technique de culture libre-prometteur. Il est souvent utilisé en microbiologie environnementale à analyser phylogénies microbiennes liées à certaines activités métaboliques. Ce résultat est obtenu en suivant les isotopes stables, marqué atomes de substrats en biomarqueurs microbiens, tels que des acides gras de phospholipides dérivés, l'ADN et l'ARN 5. Lorsque l'on considère les acides nucléiques, la méthode est basée sur la séparation de l'ADN 13 marqué au carbone ou de l'ARN à partir de l'ADN non marqué par ultracentrifugation en gradient de densité-6. En raison de cette connexion directe entre le marqueur d'ADN et l'activité métabolique, une analyse moléculaire en aval des acides nucléiques identifie les espèces et fournit des informations sur les activités métaboliques. En outre, la combinaison de l'ADN-SIP et pyroséquençage appliquée parPilloni, von Netzer, et al. 15, permet une identification simple et sensible notamment des espèces bactériennes présentes dans la fraction lourde de 13 C-ADN marqué. Jusqu'à présent, cette technique a été appliquée pour décrire les communautés bactériennes impliquées dans les processus biogéochimiques dans le sol sous aérobies et anaérobies 16,17 18,19 conditions. Outre l'utilisation en sciences de l'environnement, la technique a été appliquée dans les sciences médicales tel que rapporté par Reichardt, et al. 5, qui décrit les activités métaboliques des différents groupes phylogénétiques du microbiote intestinal humain en réponse à un glucide non digestible.
Ici, nous utilisons 13 C-glucose de «label» de l'ADN des espèces bactériennes métaboliquement actives dans l'intestin. Le glucose est un sucre utilisé par la plupart des espèces bactériennes le long de la voie généralisée Entner-Doudoroff (ED), bien que des exceptions sont connues 20. Cejustifie l'utilisation de 13 C-glucose comme sonde métabolique fiable qui fournit un lien entre les métabolites d'intérêt et la source de carbone le long des voies établies. En fonction de la question scientifique, d'autres substrats, à savoir 13 C-méthane, le 13 CO 2, ou de plantes obtenues sous une atmosphère de 13 CO 2, peut être utilisé pour traiter des activités métaboliques.
À ce stade, nous présentons le protocole appliqué dans la caractérisation métabolique de la communauté bactérienne de l'intestin d'un insecte généraliste, à savoir S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). En outre, la technique a été couplé à pyroséquençage, qui à son tour permet l'identification de la communauté bactérienne de l'intestin des insectes avec une haute résolution et de précision. Comme le substrat principal, 13 C-glucose marqué a été utilisé au cours des expériences.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'intestin de la plupart des insectes abrite une communauté microbienne riche et complexe; généralement 10 7 -10 9 cellules procaryotes déposer là, plus nombreux que les propres cellules de l'hôte dans la plupart des cas. Ainsi, l'intestin de l'insecte est un "point chaud" pour les activités microbiennes différentes, représentant de multiples aspects des relations microbiennes, de la pathogenèse d'obliger mutualisme 27. Bien que de nombreuses étud…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Angelika Berg à l'aide de laboratoire. Ce travail a été soutenu et financé par la Société Max Planck et l'École Jena for Microbial Communication (JSMC).
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
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