Kültürlü ve Gut metabolik Aktif Bakterilerin Tanımlanması<em> Spodoptera littoralis</em> DNA Kararlı İzotop yoluyla kullanma Probing<sup> 13</sup> C = Glukoz
Summary
Spodoptera littoralis gut ile ilişkili aktif bakteriyel topluluk, piro sıralamadır bağlanmış kararlı-izotop-tarama (SIP) ile belirlenmiştir. Bu yöntemi kullanarak, toplum içinde aktif metabolik bakteri türlerinin belirlenmesi, yüksek çözünürlük ve hassasiyet ile yapıldı.
Abstract
Çoğu böceklerin bağırsaklar simbiyotik patojenik bakterilerin karmaşık topluluklar tarafından iskan. Bu tür mikrobiyal topluluklar içinde bu ortakçı veya mutualistik bakteri türleri tanımlamak mümkündür. İkincisi olanlar, örneğin, diğerlerinin yanı sıra, temel amino asitler 4 sentezi de dahil olmak üzere, immün yanıtı 2, feromon üretim 3, hem de beslenme artırılması, böcek üreme 1 'de yardımcı böcek birden fazla fonksiyona hizmet ettiği gözlenmiştir.
Nedeniyle bu derneklerin önemine, birçok çabaların bireysel üyeleri aşağı toplulukları karakterize etmek için yapılmıştır. Ancak, bu çabaların çoğu ya ekimi yöntemlerine dayalı veya nihai tanımlama için dizilmiştir 16S rRNA gen parçalarının üretimi dayanıyordu edildi. Ne yazık ki, bu yaklaşım, sadece, bağırsakta mevcut olan bakteri türleri belirlenmiştir ve hiçbir informat ResimMikroorganizmaların metabolik aktivitesi üzerinde iyon.
Bir böceğin bağırsağında metabolik olarak aktif bakteri türünü karakterize etmek için, evrensel bir alt-tabaka olarak 13 C-glukoz kullanılarak in vivo (SIP) tarama ve sabit izotop kullanılır. Bu kendi özel metabolik aktivite mikrobiyal filogenilerin bağlantısını sağlayan ümit verici bir kültür-free tekniktir. Bu, DNA ve RNA 5 gibi mikrobiyal belirteçler, içine yüzeylerde istikrarlı, izotop işaretli atomları takip mümkündür. DNA, etiketlenmemiş (12 ° C) ile karşılaştırıldığında etiketlenmiş DNA yoğunluğunu arttırır içine 13 ° C arasında birleşme izotopları. Sonunda, 13C-etiketli DNA ya da RNA, 12 C-etiketli olmayan benzer bir 6 ila yoğunluk gradyanlı ultra-santrifüj ile ayrılır. Ayrılmış olan bir nükleik asit isotopomers daha sonraki moleküler analizi türlerin metabolizma aktivitesi ve kimlik arasındaki bağlantıyı sağlar.
Burada, bir kültürlü bir böcek (bizim model sistem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae) bağırsağında metabolik olarak aktif bakterileri tanımlamak için kullanılan bir protokol mevcut. DNA filogenetik analizi, böcek bağırsağı bakteri eden tanımlanmasında yüksek çözünürlük ve hassasiyet izin piro sıralamadır, kullanılarak yapıldı. Ana substrat olarak, 13 C-etiketli glikoz deneylerde kullanılmıştır. Substrat yapay bir diyet kullanılarak böcekler beslenmiştir.
Introduction
Böcek-bakteriyel sembiyotik dernekler böcek türlerine 7 çok sayıda için bilinir. Bu simbiyotik dernek, mikroorganizmalar böceklerin büyüme ve gelişmesinde önemli rol oynar. Mikroplar konakçıya böcek temel amino asitler 4 sentezi de dahil olmak üzere üretimi 1, feromon biyosentezi 3, beslenme ve sindirim ulaşılmaz gıda katkı gösterilmiştir. Gut-bakteriyel dernekleri çok çeşitli olmasına rağmen, çok az onlar böcek lehine oynamak işlevsel rolü hakkında bilinmektedir. Sadece termitlerin durumunda, lignoselüloz simbiyotik sindirim prokaryotlar, protozoa ve mantarlar tarafından yürütülen yaygın olarak 8,9 incelenmiştir. Buna zıt olarak, az kültürlü böceklerin bağırsağında pamuk yaprak kurdu yani içinde mevcut olan simbiyotik ilişkisi hakkında bilinen, Spodoptera genel nedeniyle bitki konak sıkça kayması, Ayrıca. Littoralisist böcekler ve bağırsak ilişkili bakteri toplulukları kalıcı olarak beslenme alışkanlıkları fitokimyasallar bir bolluk ile bitkileri tüketen bağlantılı yeni sorunlara maruz kalırlar. Bunun yanında lepidopteranlara olarak bağırsak ortamında, per se çünkü yüksek bağırsak pH 10 Bakterilerin büyümesi için bir sert çevre temsil eder. Özellikle S. durumunda littoralis, bu aralıkları foregut de 10.5 'den, midgut ca. 9. neredeyse 7 hindgut 11'inde, pH. Diğer yandan, bakteri toplum S. gut ile ilişkili littoralis basittir. Tang, Freitak, et al. 12, bu böcek ilişkili bakteri eden tek üyesi olarak 7 farklı bakteri türlerinin toplam ait 36 Şlotip en fazla rapor etmiştir. Bunun yanı sıra, herhangi bir karmaşık bir yetiştirme prosedürü laboratuarda böcek büyümesi için gereklidir. Ayrıca, bu ve böceğin kısa yaşam döngüsü çok g kolaylaştırmakenerational çalışmalar, bağırsak mikrop etkileşimleri çalışmak için ideal bir model sistem içine bu tür dönüm.
PCR-tabanlı dizileme teknolojileri ile birlikte, çeşitli organizmaların (yani insan, böcek veya deniz canlıları) gut biota ile ilgili çalışmaların sayısı artmıştır. Ayrıca, sonuçlar, geçmişte olduğu gibi izolasyon ve gut barındıran bakteri yetiştirme bağımsızdır. Bakterilerin% 99'u ekilebilir değildir ve bağırsaktaki hakim çevre koşullarının simülasyonu 12. zordur. PCR kullanarak, 16S rRNA gen fragmanları (bakteriler arasında yaygın olarak kullanılan bir filogenetik geninin markör) seçici olarak dizilenmiştir bağırsak bakteri topluluklarının, karışık bir DNA şablonu amplifiye ve klonlanabilir. Bu bilgi ile, kullanıcı kamu veritabanları 13,14 sekans bilgileri aldıktan sonra bakteri türlerini tespit etmek mümkün değildir. Bununla birlikte, dizileme, bakteri tanımlamak için yaklaşımlartopluluklar nedeniyle toplum içinde bireysel türlerin içsel metabolik katkısı hakkında bilgi eksikliği yetersiz kalır.
Kararlı izotop (SIP) sondalama gelecek vaat eden bir kültür-free tekniktir. Bu genellikle belirli metabolik faaliyetlerle bağlantılı mikrobiyal filogenezlerini analiz çevre mikrobiyolojisi kullanılır. Bu, fosfolipid türetilen yağlı asitler, DNA ve RNA gibi mikrobik biyolojik 5, alt-tabakalar olarak istikrarlı, izotop işaretli atomuna takip ederek elde edilir. Nükleik asitler göz önüne alındığında, bu yöntemin yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü ile 6 etiketlenmemiş DNA'dan 13 C-etiketli DNA ya da RNA'nın ayrılması üzerine dayanır. Nedeniyle DNA etiket ve metabolik aktivite arasındaki doğrudan bağlantı için, nükleik asitlerin bir alt analiz moleküler türlerin tanımlar ve metabolik faaliyetleri ile ilgili bilgi sağlar. Ayrıca, DNA-ve SIP, piro sıralamadır kombinasyonu tarafından uygulananPilloni, von Netzer, et al. 15 ağır 13C-etiketli DNA fraksiyonunda mevcut olan bakteri türlerinin özellikle basit ve hassas bir şekilde tanımlanmalarına olanak sağlar. Şimdiye kadar, bu teknik, 16,17 aerobik ve anaerobik koşullar altında 18,19 toprakta biyokimyasal süreçlerde bakteriyel toplulukları tarif etmek için uygulanmıştır. Sindirilmeyen karbonhidrat tepki olarak insan intestinal mikrobiyota farklı filogenetik gruplar metabolik faaliyetleri tarif Reichardt, et al. 5 tarafından bildirilen gibi çevresel biliminde kullanım yanı sıra, teknik tıp bilimlerinde uygulanmıştır.
Burada bağırsakta metabolik olarak aktif bakteri türlerinin DNA 'etiket' için 13 C-glikoz kullanımı. Glukoz durumlar 20 bilinmesine rağmen, yaygın Entner-Doudoroff (ED) yolu boyunca pek çok bakteri türleri tarafından kullanılan bir şekerdir. Builgi metabolitleri ve kurulan yollar boyunca karbon kaynağı arasındaki bir bağlantı sağlayan güvenilir metabolik prob olarak 13 C-glikoz kullanımını haklı. Bilimsel Söz, başka alt-tabakalar, örneğin, 13 C-metan, 13 CO2, ya da bir 13 CO2 atmosferi altında yükseltilmiş bitki bağlı olarak, metabolik faaliyetleri gidermek için kullanılabilir.
Bu noktada, bir genel böcek, yani S. bağırsak bakteri topluluğunun metabolik karakterizasyonunda uygulanan protokol mevcut littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Ayrıca, bu metod da yüksek çözünürlük ve hassasiyet ile böcek bağırsağı bakteri topluluğunun belirlenmesini sağlar, piro sıralamadır, bağlanmıştır. Ana tabaka olarak, 13 C-etiketli glikoz deneylerde kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çoğu böceklerin bağırsak zengin ve karmaşık bir mikrobiyal topluluğu barındırır; genellikle 10 7 -10 9 prokaryotik hücrelerin çoğu durumda konağın kendi hücrelerini outnumbering, orada Köşkü. Böylece, böcek bağırsak karşılıkçılığını 27 yükümlülük altına patogenezden mikrobiyal ilişkilerin birden yönlerini temsil eden çeşitli mikrobiyal faaliyetler için bir "sıcak nokta", olduğunu. Birçok çalışma böcek bağırsak mikrobiyal toplu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz laboratuvar yardım için Angelika Berg teşekkür ederim. Bu çalışma Max Planck Derneği ve Mikrobiyal İletişim (JSMC) için Jena Okulu tarafından desteklenen ve finanse edilmiştir.
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
Referencias
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A., VH, R. e. s. h., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution – a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
