제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별<em> 스포 도프 테라 리토 랄</em> DNA 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙<sup> 13</sup> C-포도당
Summary
스포 도프 테라 리토 랄리스의 가트와 연관된 활성 박테리아 여행자는 pyrosequencing 기법에 결합 안정 동위체 프로빙 (SIP)에 의해 결정되었다. 이 방법을 사용하여, 지역 사회 내에서 대사 활성 박테리아 종의 식별은 높은 해상도와 정밀도로 이루어졌다.
Abstract
대부분의 곤충의 내장은 공생 비병원성 박테리아의 복잡한 사회에서 살고있다. 이러한 미생물 지역 사회 내에서 그것은 공생이나 공생 박테리아 종을 식별 할 수 있습니다. 후자의 것, 즉 다른 사람의 사이에서, 필수 아미노산 (4)의 합성을 포함하여 면역 반응 2, 페로몬 생산 3,뿐만 아니라 영양을 증폭, 곤충 재생 1 도움, 곤충에 여러 기능을 제공하는 것으로 관찰되었다.
때문에 이러한 연결의 중요성에 많은 노력이 개별 구성원에 이르기까지 지역 사회의 특성을되었습니다. 그러나, 이러한 노력의 대부분은 하나 재배 방법에 근거하거나 최종 식별 서열화 된 16S rRNA 유전자 단편의 생성에 의존 하였다. 불행히도, 이러한 방법은 장내에 존재하는 세균 종을 파악하고 더 INFORMAT을 제공하지미생물의 대사 활동에 이온.
곤충의 창자의 대사 활성 세균 종의 특성을 위해, 우리는 보편적 인 기질로 13 C-포도당을 이용한 생체 내 (SIP)를 프로빙 안정 동위 원소를 사용했습니다. 이것은 그들의 특정 신진 대사 활동에 미생물 계통의 결합을 할 수있는 유망한 문화가없는 기술이다. 이는 DNA와 RNA 5와 같은 미생물의 생체에 기판에서 안정 동위 원소 표지 원자를 추적 가능합니다. DNA가 비 표지 (12 C)에 비해 한 표지 DNA의 밀도를 증가시킨다 (13)에 C의 혼입 동위 원소. 결국, 13 C-표지 된 DNA 또는 RNA는 12 C-레이블이없는 유사 하나 6에서 밀도 구배 초 원심 분리에 의해 분리된다. 분리 된 핵산 분자 동위 원소의 후속 분석 종의 대사 활동 및 ID 사이의 연결을 제공한다.
여기에서, 우리는 제너럴 곤충 (우리의 모델 시스템), 스포 도프 테라 리토 랄 (나비목, Noctuidae)의 창자에있는 대사 활성 박테리아의 특성을하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. DNA의 계통 발생 학적 분석은 곤충 장내 세균 공동체의 식별에 높은 해상도와 정밀도를 허용 pyrosequencing 기법을 사용하여 수행 하였다. 메인 기판으로서, 13 C-표지 된 글루코스가 실험에 사용 하였다. 기판은 인공 사료를 사용하여 곤충에 공급 하였다.
Introduction
곤충 박테리아의 공생 협회는 곤충 종 7의 큰 숫자에 대한 알려져있다. 이러한 공생 협회에서, 미생물은 곤충의 성장과 발달에 중요한 역할을한다. 미생물은 호스트에 곤충 필수 아미노산 (4)의 합성을 포함하여 재생 1, 페로몬 생합성 3, 영양, 및 액세스 음식의 소화에 기여하는 것으로 나타났다. 장내 세균 협회의 광대 한 다양한에도 불구하고, 훨씬 적은들은 곤충에 찬성 재생 기능 역할에 대한 알려져있다. 만 흰개미의 경우에는 목질 섬유소의 공생 소화가 원핵 생물, 원생 동물, 곰팡이에 의해 수행, 널리 8,9를 공부하고 있습니다. 이와 대조적으로, 거의가 제너럴 곤충의 용기면 leafworm 즉에 존재하는 공생 관계에 대해 잘 알려져 있습니다, 스포 도프 테라는 일반적으로 인해 식물 호스트의 자신의 빈번한 이동에, 또한. 리토 랄IST 곤충과 그들의 창자 관련된 세균성 지역 사회가 영구적으로 자신의 식습관은 식물성 화학 물질의 과다로 식물을 소비에 연결된 새로운 도전에 노출되어 있습니다. 이 옆에 lepidopterans의 창자 환경은 본질적으로 높기 때문에 장내의 pH 10의 박테리아의 성장을위한 가혹한 환경을 나타냅니다. 특히 S.의 경우 리토 랄, 그것은 범위 foregut 10.5에서 중장 캘리포니아. 9 거의 7 hindgut (11)를 PH합니다. 한편, 세균성 커뮤니티 S.의 가트와 관련된 리토 랄은 간단합니다. 당나라, Freitak, 등. (12)는이 곤충과 관련된 세균성 지역 사회의 구성원 만 아니라 7 개의 다른 박테리아 종의 총에 속하는 36 phylotypes 최대를보고했다. 이 외에도, 복잡한 양육 절차는 실험실에서 곤충 성장을 위해 필요하지 않습니다. 또한, 이것과 곤충의 짧은 수명주기가 다 g 용이enerational 연구, 창자 – 미생물 상호 작용 연구를위한 이상적인 모델 시스템에이 종을 선회.
PCR 기반 시퀀싱 기술의 출현으로, 몇개의 미생물 (즉, 인간, 곤충이나 해양 생물)의 가트 생물상 다루는 연구의 수는 증가하고있다. 더욱이, 결과는 과거뿐만 고립과 가트 숨겨 세균 배양으로부터 독립적이다. 박테리아의 약 99 %는 경작되지 않고 장내에서 일반적인 환경 조건의 시뮬레이션은 12 어렵다. PCR을 이용하여 16S rRNA 유전자 단편 (세균 가운데 널리 계통 유전자 마커) 선택적 서열화 가트 세균 공동체의 혼합 DNA 템플릿에서 증폭 및 복제 될 수있다. 이 정보를 통해, 사용자는 공개 13,14 데이터베이스로부터 서열 정보를 검색 한 후 종의 박테리아를 식별 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 순서는 박테리아를 설명하는 접근사회 인해 지역 사회 내의 개별 종의 고유 대사 공헌에 대한 정보의 부족으로 충분한 남아있다.
안정 동위 원소 (SIP)를 프로빙 유망 문화가없는 기술이다. 그것은 종종 특정 신진 대사 활동에 링크 된 미생물의 계통 발생을 분석하는 환경 미생물학에서 사용된다. 이는 같은 인지질 유래 지방산, DNA 및 RNA 5와 같은 미생물의 생체에 기판에서 안정 동위 원소 표지 원자를 추적하여 달성된다. 핵산을 고려하면, 방법론은 밀도 구배 초 원심 분리 (6)에 의해 비 표지 DNA의 13 C-표지 된 DNA 또는 RNA의 분리에 기초한다. 때문에 DNA 라벨과 신진 대사 활동 사이의 직접 연결로, 핵산의 하류 분자 분석은 종을 식별하고 신진 대사 활동에 대한 정보를 제공합니다. 또한, DNA-SIP와 pyrosequencing 기법의 조합에 의해 적용되는Pilloni 폰 쩌르 교수, 등. (15)는 무거운 13 C-표지 된 DNA 분획에 존재하는 세균 종의 특정 간단하고 민감한 식별을 허용합니다. 지금까지이 기술은 호기성 및 혐기성 조건 16, 17, 18, 19에서 토양 생지 화학 과정에 포함 된 세균의 지역 사회를 설명하기 위해 적용되었습니다. 난소 화성 탄수화물에 대한 응답으로 인간의 장내 미생물의 서로 다른 계통 발생 그룹의 신진 대사 활동을 설명 Reichardt, 등. 5에 의해보고 된 환경 과학에서의 사용 외에,이 기술은 의료 과학에 적용되었습니다.
여기에서 우리는 창자의 대사 활성 박테리아 종의 DNA '라벨'에 13 C-포도당을 사용합니다. 포도당은 예외가 20 알려져 있지만, 광범위한 엔트 – Doudoroff (ED) 경로를 따라 대부분의 세균 종에 의해 이용 당합니다. 이또한 대사 확립 경로를 따라 탄소원 간의 링크를 제공 신뢰성 대사 프로브로서 13 C-글루코스 사용을 정당화한다. 과학적 질문에, 다른 기판, 즉 13 C-메탄, 13 CO 2, 13 CO 2 분위기하에 발생 식물에 따라 대사 활동을 해결하는데 사용될 수있다.
이 시점에서, 우리는 제너럴 곤충, 즉 S.의 장내 세균 공동체의 대사 특성에 적용되는 프로토콜을 제시한다 리토 랄 (나비목, Noctuidae). 또한, 기술은 다시 높은 해상도와 정밀도를 가진 곤충 장내 세균 공동체의 식별을 허용 pyrosequencing 기법에 결합했다. 메인 기판으로서, 13 C-표지 된 글루코스는 실험 동안 사용 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
대부분의 곤충의 창자는 풍부하고 복잡한 미생물 군집을 품고, 일반적으로 10 ~ 12 -10 9 원핵 세포는 대부분의 경우 호스트의 자신의 세포를 상회하는, 거기에 제기. 따라서, 곤충의 창자는 상리 공생 (27)를 의무하는 기전에서 미생물 관계의 여러 측면을 대표하는 다양한 미생물의 활동에 대한 "핫 스팟"입니다. 많은 연구가 곤충 장내 미생물 사회의 놀라운 다양성을 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 실험실 지원되었습니다 Angelika 버그 감사합니다. 이 작품은 막스 플랑크 사회와 미생물 통신 (JSMC)에 대한 예나 학교에서 지원하고 자금을했다.
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
Referencias
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