Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

Resumen

Aquí, se desarrolla un novedoso ensayo de fluorescencia cuantitativa para medir los cambios en el nivel de una proteína, específicamente en los centrosomas, normalizando la intensidad de fluorescencia de esa proteína a la de un estándar interno apropiado.

Resumen

Los centrosomas son pequeñas pero importantes orgánulos que sirven como los polos del huso mitótico para mantener la integridad genómica o ensamblar cilios primarios para facilitar las funciones sensoriales en las células. El nivel de una proteína puede ser regulada de manera diferente en los centrosomas que en otros lugares .cellular, y la variación en el nivel centrosomal de varias proteínas en diferentes puntos del ciclo celular parece ser crucial para la adecuada regulación de montaje centríolo. Hemos desarrollado un ensayo de microscopía de fluorescencia cuantitativa que mide los cambios relativos en el nivel de una proteína en los centrosomas en células fijadas de diferentes muestras, tales como en las diferentes fases del ciclo celular o después del tratamiento con varios reactivos. El principio de este ensayo radica en la medición de la intensidad fluorescente con corrección de fondo correspondiente a una proteína en una pequeña región, y normalizar que la medición contra el mismo para otra proteína que no varía bajo la c experimental elegidoondition. Utilizando este ensayo en combinación con pulso de BrdU y la estrategia de persecución para estudiar ciclos celulares no perturbadas, hemos validado cuantitativamente nuestra reciente observación de que la piscina centrosomal de VDAC3 está regulada a centrosomas durante el ciclo celular, probablemente por la degradación mediada por proteasoma específicamente a los centrosomas.

Introducción

Los centrosomas consisten en un par de centriolos rodeados por el material pericentriolar (PCM). Siendo los principales centros organizadores de microtúbulos (COMT) en células de mamíferos, los centrosomas actúan como los dos polos de husos mitóticos en células en división, y por lo tanto ayudan a mantener la integridad genómica ^1. En las células quiescentes (por ejemplo, durante la fase G0), uno de los dos centriolos del centrosoma, a saber, el centríolo madre, se transforma en un cuerpo basal de montar el cilio primario, un orgánulo sensorial que sobresale hacia fuera de la superficie de la célula ^2. Una vez que las células vuelvan a ....

Protocolo

1. Cultivo Celular

1. Utilice la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), las células epiteliales del pigmento de la retina inmortalizadas (hTERT-RPE1; se hace referencia aquí como RPE1).
   NOTA: RPE1 células son células humanas diploides, casi no transformadas que se utilizan comúnmente para estudiar el montaje centriolo y ciliogenesis. Estas células siguen un ciclo normal de duplicación centriolo coordinado con un ciclo celular regulado.
2. Passage un casi confluente 100 mm placa de cultivo celular de las células RPE1 a 1: 5 dilución del cultivo original en un plato de 100 mm fresco que contiene 10 ml de DME / F-12 (1: 1) el medio suplem....

Resultados

Nuestros estudios recientes identificaron novela localización centrosomal y la función de VDAC3, una de las porinas mitocondriales ^16,28. La inmunotinción de varias células de mamíferos que incluyen células RPE1 utilizando un anticuerpo VDAC3 específica mostró prominente tinción centrosomal y comparativamente débil tinción mitocondrial. También demostramos que VDAC3 centrosomal se asocia preferentemente con el centríolo madre, y la piscina centrosomal tanto de la endógena y expresó ectópica VDAC3 está regulad.......

Discusión

Microscopía cuantitativa en biología celular se asocia comúnmente con los ensayos de formación de imágenes de células vivas, como Energía de Resonancia Fluorescente Transfer (FRET), la fluorescencia de recuperación después de photobleaching (FRAP), etc. Sin embargo, hay cada vez más ejemplos de los biólogos celulares en desarrollo diferentes ensayos de microscopía cuantitativos para fijo las células en los últimos años ^27,34-36. Es importante destacar que, el progreso en la comprensión de la biología.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fibronectina	Sigma	F8141	Stock de 1 mg/ml en agua
DMSO	Sigma	D2650
MG115	Sigma		SCP0005 Stock de 10 mM en DMSO
BrdU	Sigma	B5002	Stock de 10 mM en DMSO
Anti-γ-tubulina (monoclonal de ratón, clon GTU 88)	Sigma	T 6557	1:200 en tampón de bloqueo IIF
Anti-VDAC3 (policlonal de conejo)	Aviva Systems Biology	ARP35180-P050	1:50 en tampón de bloqueo IIF, 1:1.000 en tampón de bloqueo
WB Anti-Sas6 (monoclonal de ratón)	Santa cruz biotechnology	sc-81431	1:100 en tampón de bloqueo
IIF Anti-Cep135 (policlonal de conejo)	Abcam	ab-75005	1:500 en tampón de bloqueo IIF
Anti-BrdU (monoclonal de rata)	Abcam	ab6326	1:250 en tampón de bloqueo IIF
Alexa Fluor 350 Cabra Anti-Rata IgG (H+L)	Life technologies	A21093	1:200 en tampón de bloqueo IIF
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21202	1:1.000 en IIF tampón
de bloqueo Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21203	1:1.000 en IIF tampón de bloqueo
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21206	1:1.000 en IIF tampón de bloqueo
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21207	1:1.000 en IIF tampón de bloqueo
Anti-γ-tubulina (policlonal de conejo)	Sigma	T5192	1:1.000 en WB tampón
de bloqueoAnti-α-tubulina (monoclonal de ratón, DM1A)	Sigma	T9026	1:20.000 en tampón de bloqueo de WB
Alexa Fluor 680 Burro Anti-Conejo IgG (H+L)	Life technologies	A10043	1:10.000 en tampón de bloqueo WB
IgG de ratón (H& L) Anticuerpo IRDye800CW Anticuerpos Rockland conjugados		610-731-002	1:10,000 en tampón de bloqueo WB
SlowFade Gold Antifade Reagent	Life technologies	S36936	Medios de montaje
Cubreobjetos redondos 12CIR.-1	Fisherbrand	12-545-80
Microscopio Olympus IX-81	Cámara Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR	QImaging	32-0082B-238
Objetivo de inmersión en aceite 100X Plan Apo	Apertura numérica	Olympus
Paquete de software de diapositivas	Innovaciones en imágenes inteligentes Sistema de
imagen IR Odyssey Li-cor	Biosciences Ensayo de
ácido bicinconínico (BCA)	Thermo Scientific	23227
U-MNU2 Cubo	UV estrechoFiltro Olympus	U-M622
U-MNU2 Cubo Azul Estrecho	Filtro Olympus	U-M643
U-MNU2 Cubo Verde Estrecho	Filtro		Olympus U-M663

1.4