الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes
Summary
Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.
Abstract
Centrosomes هي عضيات صغيرة ولكنها مهمة التي تشكل أقطاب الإنقسامية المغزل للحفاظ على سلامة الجينوم أو التجمع أهداب الأساسي لتسهيل مهام الحسية في الخلايا. يجوز تنظيم مستوى بروتين مختلف في centrosomes من في مواقع .cellular أخرى، والاختلاف في مستوى centrosomal من عدة بروتينات في نقاط مختلفة من دورة الخلية ويبدو أن تكون حاسمة لتنظيم السليم التجمع مريكز. قمنا بتطوير مضان الكمي المجهري الفحص الذي يقيس التغيرات النسبية في مستوى البروتين في centrosomes في الخلايا الثابتة من عينات مختلفة، مثل في مراحل مختلفة من دورة الخلية أو بعد العلاج مع مختلف الكواشف. مبدأ هذا الاختبار يكمن في قياس الخلفية تصحيح كثافة الفلورسنت المقابلة لبروتين في منطقة صغيرة، وتطبيع أن قياس ضد نفسه للبروتين آخر لا تختلف تحت ج التجريبية المختارةondition. استخدام هذا الاختبار في تركيبة مع نبض BrdU واستراتيجية مطاردة لدراسة دورات خلية رابط الجأش، لدينا التحقق من صحة كميا الملاحظة الأخيرة في أن ينظم التجمع centrosomal من VDAC3 في centrosomes خلال دورة الخلية، من المحتمل بسبب تدهور بوساطة proteasome وتحديدا في centrosomes.
Introduction
تتكون Centrosomes من زوج من centrioles محاطة المواد محيط بالمريكز (PCM). يجري المراكز الرئيسية أنيبيب المنظمة (MTOCs) في خلايا الثدييات، centrosomes بمثابة قطبي مغزل الإنقسامية في تقسيم الخلايا، وبالتالي تساعد على الحفاظ على سلامة الجينوم 1. في الخلايا هادئة (على سبيل المثال، خلال مرحلة G0)، واحد من اثنين من centrioles من الجسيم المركزي، وهي مريكز الأم، وتحويلها إلى هيئة القاعدية لتجميع هدب الابتدائي، عضية الحسية جاحظ الخروج من سطح الخلية 2. مرة واحدة الخلايا إعادة إدخال دورة الخلية، ويتم تفكيكها أهداب الابتدائي وكل مريكز يوجه التجمع من طليعة المريكز في نهايته القريبة أن يستطيل تدريجيا لتشكيل مريكز ناضجة 3. في بداية S-المرحلة، يتم تشكيل بنية تشبه عجلة العربة التي توفر التماثل 9 أضعاف إلى مريكز على سطح كل مريكز القائمة وسوف تصبح قاعدة كل طليعة المريكز. Sas6 رقبعة أمر لا غنى عنه ليتم تجنيده التجمع مريكز لتشكيل محور عجلة العربة 4-6. ثم يتم تجميع البروتينات مريكزي أخرى على عجلة العربة في درجة عالية من التنظيم، الأقرب إلى الطريقة البعيدة 7. بعد الانتهاء بالضبط الازدواجية مريكز، وخلايا تجميع المواد محيط بالمريكز إضافية لبناء اثنين centrosomes وظيفية بحلول نهاية المرحلة G2 8. وبالإضافة إلى المكونات الأساسية مريكزي 9-11، والعديد من البروتينات الأخرى بما في ذلك تحركات، الفسفاتازات، مرافقين، مكونات سقالة، غشاء البروتينات المرتبطة بها والآلات تدهور ترتبط مع centrioles والهيئات القاعدية وPCM في أوقات مختلفة من دورة الخلية 12-16. ويلاحظ في كثير من الأحيان أن مستويات centrosomal من العديد من البروتينات تنظم زمنيا من قبل آليات الاستهداف centrosomal و / أو تدهور proteasomal في centrosomes. الأهم من ذلك أن التقلبات في مستوى centrosomal من عدة بروتينات مثل Plk4، Mps1، Sas6، وCP110 لنقاط ر مختلفة من دورة الخلية ويبدو أن تكون حاسمة لتنظيم التجمع مريكز 5،17-22، وفي حالة Mps1 منع هذا التدهور centrosomal يؤدي إلى تشكيل centrioles الزائدة 19. من ناحية أخرى، فإن الكسور centrosomal من عدة بروتينات أقل عطوب بالمقارنة مع حمامات عصاري خلوي. على سبيل المثال سيرنا بوساطة أسفل تنظيم Centrin 2 (Cetn2) أدى إلى سوى انخفاض معتدل من مستوى البروتين في centrioles على الرغم من انخفاض كبير في مستوياته خلية كاملة 23. ولذا فمن الأهمية بمكان لقياس التغيرات في مستوى البروتينات centrosomal في الجسيم المركزي بدلا من قياس مستويات البروتين خلية كاملة عند تقييم وظائف الجسيم المركزي الخاصة بهم.
في هذه الدراسة قمنا بتطوير فحص باستخدام المناعي غير المباشر (معهد التمويل الدولي) لتحديد المستوى النسبي للبروتين في centrosomes. تم تطوير هذا الفحص بشكل خاص لتحليل الخلايا التي هي من عينات مختلفةوبالتالي لا يمكن تصويرها في نفس الوقت. ويمكن لهذه العينات أن تكون الخلايا التي تم التعامل مع الكواشف المختلفة (أي المخدرات مقابل السيطرة)، التي تم جمعها في نقاط زمنية مختلفة (أي نبض مقابل مطاردة)، أو هي في مراحل مختلفة من دورة الخلية. مبدأ هذا الاختبار يكمن في قياس الخلفية تصحيح كثافة الفلورسنت المقابلة لبروتين في منطقة صغيرة وتطبيع تلك القيمة ضد نفسه للبروتين آخر والتي لا تختلف في ظل الظروف التجريبية اختيار المستويات. وقد استخدمت العديد من الدراسات في علم الأحياء الجسيم المركزي مؤخرا مختلف تقنيات المجهر الكمية، في كل الخلايا الحية أو الثابتة، لتحديد وظيفة الجسيم المركزي محددة من البروتينات مرشح 24-27. مماثلة لتلك المقايسات، والتقنية الحالية أيضا يقيس الخلفية تصحيح كثافة مضان من البروتين الاختبار. ومع ذلك، فإن إدراج تطبيع باستخدام معيار الداخلي في هذا الاختبار من المرجح تقديم أكبردقة وثقة في تحليل عينتين المختلفة التي هي على اثنين من coverslips مختلفة. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى فحص مستوى البروتين في centrosomes، مع تعديلات طفيفة هذه الطريقة يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية أو في مواقع الخلوية الأخرى.
هنا، ونحن لدينا الجمع بين الكمي المجهري الفحص مع استراتيجية نبض مطاردة BrdU لمقارنة الخلايا من مختلف مراحل دورة الخلية. بدلا من استخدام التقنيات القياسية اعتقال دورة الخلية وإطلاق لدراسة مختلف نقاط زمنية دورة الخلية، وخلايا المتزايد بشكل غير متزامن يتم تحضين مع BrdU لتسمية الخلايا في S-المرحلة، ومطاردة الخلايا المسمى لأوقات مختلفة (عادة 4-6 ساعة). ومعظم الخلايا المسمى يكون في S-المرحلة مباشرة بعد النبض. يتم اختيار طول مطاردة وذلك بعد مطاردة، الخلايا المسمى سيكون في أواخر S، G2، أو الانقسام، والتي يمكن التحقق منها من قبل الخصائص المورفولوجية مثل هذا الموقف الفلك من centrosomes فيما يتعلق مجلس التوحيد الوطنىليو، وبعد المسافة بين centrosomes، والتكثيف من الكروموسومات الخ وهكذا، وطول مطاردة يعتمد على متوسط مدة S، M G2 ومرحلة من نوع خلية معينة. منذ هذا النهج يتجنب مثبطات دورة الخلية مثل هيدروكسي يوريا، aphidicolin، نوكودازول، وما إلى ذلك، يتيح تحليل دورة الخلية أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية.
وبالتالي، علينا أن نظهر هنا أن الكمية الفحص المجهري مضان وحدها، أو بالاشتراك مع BrdU نبض مطاردة الفحص، هي تقنية بسيطة لكنها قوية لقياس بدقة التغيرات النسبية في مستوى centrosomal من بروتين مرشح خلال دورة الخلية رابط الجأش. قمنا بقياس مستوى centrosomal من VDAC3، وهو البروتين الذي حددنا مؤخرا في centrosomes بالإضافة إلى الميتوكوندريا 16،28، وذلك باستخدام هذه المقايسات. النتائج التي تم الحصول عليها هنا تحقق من ملاحظتنا السابقة أن تجمع centrosomal من VDAC3 ينظمه تدهور، وتختلف أيضا في dependen دورة الخليةر بطريقة 16 والتأكد من صحتها وعلاوة على ذلك إمكانية تطبيق هذا الأسلوب.
Protocol
Representative Results
Discussion
المجهر الكمي في بيولوجيا الخلية ويرتبط عادة مع فحوصات التصوير الخلية الحية، مثل نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق)، الإسفار الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP)، وما إلى ذلك، هناك أمثلة متزايد من علماء الأحياء الخلايا نامية مختلفة المقايسات المجهري الكمية لثابت الخلايا…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
Referencias
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
- Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
- Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
- Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
- Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
- Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
- Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
- Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
- Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
- Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
- Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
- Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
- Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
- Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
- Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
- Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
- Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
- Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
- Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
- Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
- Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
- Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
- Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
- Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
- Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
- Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
- Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
- Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
- Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
- Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
- Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
- Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
- Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
- Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
- Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
- Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2′-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).
