中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ
Summary
Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.
Abstract
中心体は、ゲノムの完全性を維持するか、または細胞中の感覚機能を容易にするための一次繊毛を組み立てるために紡錘体の極として機能し、小さいながらも重要な細胞小器官である。タンパク質のレベルは、他の.cellular場所でより中心体で異なって調節され得る、および細胞周期の異なる点でいくつかのタンパク質が中心体のレベルの変化は、中心小体アセンブリの適切な調節のために重要であると思われる。我々は、細胞周期の異なる段階において、または様々な試薬で処理した後、異なる試料からの固定された細胞における中心体におけるタンパク質のレベルの相対的変化を測定する定量的な蛍光顕微鏡アッセイを開発した。このアッセイの原理は、小さな領域でのタンパク質に対応するバックグラウンド補正後の蛍光強度を測定することにあり、そして選択された実験的なCの下で変化しない別のタンパク質のために同じに対してその測定値を正規化するondition。 BrdUのパルスと非摂動細胞周期を研究するチェイス戦略と組み合わせて、このアッセイを利用して、我々は定量的に明確に中心体でプロテアソームを介した分解による可能性が高いVDAC3の中心体のプールは細胞周期の間に中心体で規制されている我々の最近の観測を、検証しました。
Introduction
中心体は、中心体周辺物質（PCM）に囲まれた中心小体のペアで構成されています。哺乳動物細胞における主要な微小管組織化センター（MTOCs）なので、中心体は、分裂細胞における紡錘体の二つの極として機能するため、ゲノムの完全性1を維持するのを助ける。 （G0期の間、例えば 、）静止細胞では、中心体、すなわち母中心小体の二中心小体の一つは、一次繊毛、細胞表面2から突出する感覚細胞小器官を組み立てるために、基礎体に変換される。再入力する細胞周期細胞と、一次繊毛は分解され、各中心小体が徐々に成熟中心小体3を形成するために伸長するその近位端でprocentrioleの組み立てを指示する。 S期の開始時に、中心小体に9回対称性を提供する車輪のような構造は、既存の各中心小体の表面上に形成され、各procentrioleのベースとなる。 SAS6トン中心小体アセンブリは車輪4-6のハブを形成するために動員されるために帽子は不可欠である。その他centriolarタンパク質はその後、遠位方法7に高度に規制、近位側転上に組み立てられている。正確に中心小体の複製を完了した後、細胞がG2期8月末までに二つの機能の中心体を構築するために追加の中心体周辺材料を組み立てる。コアcentriolarコンポーネント9-11、キナーゼ、ホスファターゼ、シャペロン、足場成分は、膜結合タンパク質および分解機構を含むいくつかの他のタンパク質に加えて、細胞周期12-16の異なる時点で中心小体、基礎体とPCMと関連している。それは、多くの場合、多くのタンパク質の中心体のレベルが時間的に中心体標的化メカニズムおよび/または中心体におけるプロテアソーム分解によって調節されることに留意されたい。重要なことは、そのようなPLK4、MPS1、SAS6、およびCP110 A等のいくつかのタンパク質の中心体のレベルの変動細胞周期tの異なる点は、中心小体アセンブリ5,17-22を調節することが重要であると思われるが、この中心体の劣化を防止MPS1の場合には過剰な中心体19の形成につながる。一方で、いくつかのタンパク質の中心体画分は、細胞質のプールに比べて少なく不安定である。例えば、siRNA媒介ダウンレギュレーションセントリン2（Cetn2）のは、その全細胞レベル23で大幅な削減にもかかわらず、中心小体におけるタンパク質レベルの中程度の減少につながった。むしろ、それらの中心体の固有の機能を評価する際に、全細胞タンパク質レベルを測定するよりも、中心体における中心体タンパク質のレベルの変化を測定することが重要である。
本研究では、中心体でのタンパク質の相対レベルを定量化するために、間接免疫蛍光（IIF）を用いたアッセイを開発した。このアッセイは、特に、異なる試料に由来する細胞を分析するために開発されているしたがって、同時に撮像することができない。これらのサンプルは、異なる時点で採取異なる試薬（ すなわち 、薬物対コントロール）で処理した細胞であってもよい（ すなわち 、追跡対パルス）、または細胞周期の異なる段階にある。このアッセイの原理は、背景が小さな領域でタンパク質に対応する蛍光強度を補正し、そのレベルが選ばれた実験条件下で変化しない別のタンパク質に同じに対してその値を正規化するために測定することにある。中心体の生物学におけるいくつかの研究は、最近の候補タンパク質24-27の中心体の固有の機能を決定するために、両方の生細胞または固定細胞内の様々な定量的な顕微鏡技術を利用している。これらのアッセイと同様に、本技術は、試験タンパク質のバックグラウンド補正された蛍光強度を測定する。しかし、このアッセイにおいて内部標準を使用して正規化を含めることは、おそらく大きな提供するであろう二つの異なるカバーガラス上で2つの異なるサンプルを分析の精度と信頼。また、中心体におけるタンパク質レベルを調べることに加えて、微調整して、この方法は、実験条件の多様なセットに、または他の細胞の部位に適用することができる。
ここでは、異なる細胞周期段階の細胞を比較するためのBrdUパルスチェイス戦略我々の定量的顕微鏡アッセイを組み合わせる。代わりに、様々な細胞周期の時間点を研究するために非同期的に増殖している細胞を、標準的な細胞周期停止および放出技術を使用してのS期における細胞を標識するためにBrdUでインキュベートし、標識された細胞は、種々の時間（通常は4-6時間）のために追われている。標識された細胞のほとんどは、直ちにパルスの後にS期になります。チェイスした後、標識された細胞は、のnucに対する中心体の形態学的特徴などAS-位置によって確認することができる後期S、G2または有糸分裂になるように、チェースの長さが選択されるレイ、中心体の間の距離は、 その他の染色体の凝縮したがって、チェイスの長さはS、G2、および特定の細胞型のM相の平均持続時間に依存する。このアプローチは等ヒドロキシ、アフィジコリン、ノコダゾール、細胞周期阻害剤を回避するので、より生理学的に関連する細胞周期分析を可能にする。
従って、我々は、単独で、定量的蛍光顕微鏡アッセイ、またはBrdUのパルスチェイスアッセイと組み合わせて、正確に非摂動細胞周期の間に候補タンパク質の中心体のレベルの相対的変化を測定するためのシンプルかつ強力な技術であることをここで実証する。我々は、これらのアッセイを用いて、VDAC3の中心体レベル、我々は最近、ミトコンドリア16,28に加えて、中心体で同定されたタンパク質を測定した。結果はVDAC3の中心体のプールが劣化することによって調節されることを我々の以前の観察を確認し、ここで得られ、また、細胞周期dependenで変化トンの方法16は 、さらに、この方法の適用性を検証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞生物学における定量的な顕微鏡は、一般的に固定するための別の定量的顕微鏡アッセイを開発細胞生物の成長の例がある。しかし、 等 、（FRAP）光退色後にそのような蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、蛍光の回復などの生細胞イメージングアッセイに関連している近年の細胞27,34-36。重要なことは、中心体生物学を理解する上での進歩は、多くの場合、中心体のプールは?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
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