Kwantitatieve immunofluorescentiebepaling op het Variatie in eiwitgehalten op centrosomes Maatregel
Summary
Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.
Abstract
Centrosomen zijn kleine maar belangrijke organellen die dienen als de polen van mitotische spoel om genomische integriteit te behouden of te assembleren primaire cilia op zintuiglijke functies in cellen te vergemakkelijken. Het niveau van een eiwit verschillend geregeld op centrosomes dan bij andere .cellular locaties, en de variatie in de centrosomal niveau van verscheidene eiwitten op verschillende punten van de celcyclus wordt essentieel voor een goede regeling van centriole samenstel te zijn. We ontwikkelden een kwantitatieve fluorescentie microscopie test die relatieve veranderingen in het niveau van een eiwit op centrosomes in gefixeerde cellen van verschillende monsters, zoals in verschillende fasen van de celcyclus of na behandeling met diverse reagentia meet. Het principe van deze test ligt meten de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit die overeenkomt met een eiwit in een klein gebied en normaliseren die meting tegen dezelfde een ander eiwit dat niet varieert onder de gekozen experimentele condition. Gebruik makend van deze test in combinatie met BrdU pulse chase en strategie ongestoorde celcyclus bestuderen, hebben we kwantitatief gevalideerd onze recente waarneming dat het centrosomal pool van VDAC3 wordt geregeld op centrosomes tijdens de celcyclus, waarschijnlijk door proteasoom-gemedieerde degradatie specifiek op centrosomes.
Introduction
Centrosomes bestaan uit een paar centrioles omringd door pericentriolar materiaal (PCM). Omdat de belangrijkste microtubule organiserende centra (MTOCs) in zoogdiercellen, centrosomes dienen als de twee polen van mitotische spindel in delende cellen, en zo helpen genomische integriteit 1 behouden. In rustende cellen (bijvoorbeeld in G0-fase), één van de twee centrioles van het centrosoom, namelijk de moeder centriole, verandert in een basale lichaam de primaire cilium, een sensorische organel uitstekende uit het celoppervlak 2 monteren. Zodra de cellen opnieuw in te voeren van de celcyclus, zijn primaire cilia gedemonteerd en elk centriole regisseert de montage van een procentriole aan het proximale uiteinde die geleidelijk verlengt tot een volwassen centriole 3 vormen. Bij het begin van S-fase wordt een cartwheel structuur die de 9-voudige symmetrie de centriole verschaft gevormd op het oppervlak van elke bestaande centriole en de basis van elke procentriole worden. SAS6 thoed is onmisbaar voor centriole assemblage wordt aangeworven om de naaf van de radslag 4-6 te vormen. Andere centriolar eiwitten worden vervolgens gemonteerd op het waterrad in een sterk gereguleerde, proximaal van de distale manier 7. Na precies centriole duplicatie voltooien, cellen assembleren extra pericentriolar materialen om twee functionele centrosomes bouwen tegen het einde van de G2-fase 8. Naast de belangrijkste componenten centriolar 9-11, verscheidene andere eiwitten zoals kinasen, fosfatasen, chaperones, steiger componenten, membraan-geassocieerde eiwitten en degradatie machines zijn geassocieerd met centriolen, basaalkorrels en PCM op verschillende tijdstippen van de celcyclus 12-16. Het wordt vaak opgemerkt dat de centrosomal niveaus van veel eiwitten tijdelijk worden gereguleerd door centrosomal targeting mechanismen en / of proteasomale degradatie bij centrosomes. Belangrijk is dat de schommelingen in de centrosomal niveau van een aantal eiwitten zoals Plk4, Mps1, SAS6, en CP110 eent verschillende punten van de celcyclus lijkt cruciaal centriole samenstel 5,17-22 regelen zijn en in het geval van Mps1 voorkomen deze centrosomal degradatie leidt tot de vorming van overtollige centrioles 19. Aan de andere kant, de centrosomal fracties van verschillende eiwitten zijn minder labiel vergelijking met cytosolische pools. Bijvoorbeeld siRNA gemedieerde down-regulatie van Centrin 2 (Cetn2) leidde tot slechts een matige afname van het eiwit niveau aan het centriolen ondanks grote vermindering van de gehele cel niveau 23. Het is daarom van cruciaal belang om de veranderingen in het niveau van centrosomal eiwitten bij de centrosome meten in plaats van het meten van de gehele cel eiwit niveaus bij de beoordeling van hun centrosome-specifieke functies.
In deze studie hebben we een test met indirecte immunofluorescentie (IIF) het relatieve niveau van een eiwit op centrosomes kwantificeren ontwikkeld. Deze test is in het bijzonder ontwikkeld om cellen die uit verschillende monsters analyserenen dus niet worden afgebeeld op hetzelfde moment. Deze monsters kunnen cellen die werden behandeld met verschillende reagentia (bijv geneesmiddel versus controle), verzameld op verschillende tijdstippen (bijv puls versus chase), of in verschillende stadia van de celcyclus. Het principe van deze test ligt meten de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit die overeenkomt met een eiwit in een klein gebied en die waarde tegen dezelfde normaliseren ander eiwit waarvan de spiegels niet variëren onder de gekozen experimentele omstandigheden. Verschillende studies in centrosoom biologie onlangs gebruikt verschillende kwantitatieve microscopie, zowel levende of gefixeerde cellen, het centrosoom specifieke functie van kandidaateiwitten 24-27 bepalen. Vergelijkbaar met de testen de onderhavige techniek meet ook de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit van het onderzochte eiwit. Echter, zou de opname van de normalisatie behulp van een interne standaard in deze assay waarschijnlijk bieden meernauwkeurig en betrouwbaar analyseren twee verschillende monsters die op twee verschillende dekglaasjes. Bovendien, naast het onderzoek van de proteïne niveau centrosomes, met kleine aanpassingen deze methode kan worden toegepast op een uiteenlopende reeks experimentele omstandigheden of andere cellulaire plaatsen.
Hier combineren we onze kwantitatieve microscopie test met een BrdU pulse-chase strategie om te vergelijken cellen uit verschillende fasen van de celcyclus. In plaats van standaard celcyclus en afgifte technieken om diverse celcyclus tijdstippen bestuderen asynchroon groeiende cellen worden geïncubeerd met BrdU cellen labelen in S-fase en de gemerkte cellen worden achtervolgd diverse tijdstippen (gewoonlijk 4-6 uur). Het merendeel van de gemerkte cellen in S-fase direct na de puls. De lengte van de chase wordt gekozen zodat na de jacht, zal gelabelde cellen in late S, G2 of mitose, die kan worden geverifieerd door morfologische kenmerken zoals-positie centrosomes ten opzichte nuclei, afstand tussen centrosomes, condensatie van chromosomen etc. Dus, de lengte van de jacht afhankelijk van de gemiddelde duur van S, G2 en M-fase van een bepaald celtype. Omdat deze benadering vermijdt celcyclus inhibitoren zoals hydroxyureum, afidicoline, nocodazole, etc., is het mogelijk een meer fysiologisch relevante celcyclusanalyse.
Zo hebben we hier aangetoond dat de kwantitatieve fluorescentiemicroscopie assay alleen of in combinatie met BrdU pulse-chase analyse, is een eenvoudige maar krachtige techniek om de relatieve veranderingen in de centrosomal niveau van een kandidaat eiwit gedurende een onverstoord celcyclus nauwkeurig te meten. We maten de centrosomal niveau van VDAC3, een eiwit dat we recent geïdentificeerde bij centrosomes naast mitochondria 16,28 via deze assays. Resultaten hier verkregen controleren onze eerdere constatering dat de centrosomal pool van VDAC3 wordt geregeld door degradatie, en varieert ook in een celcyclus dependent manier 16, verder valideren van de toepasbaarheid van deze methode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kwantitatieve microscopie in de celbiologie is vaak geassocieerd met live-cell imaging assays zoals Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), fluorescentieherstel na Photobleaching (FRAP), etc. Echter, er steeds voorbeelden cel biologen ontwikkelen van verschillende kwantitatieve microscopie assays voor vaste cellen in de afgelopen jaren 27,34-36. Belangrijker nog, de vooruitgang in het begrijpen van centrosome biologie vaak vereist inzicht in de centrosome-specifieke functie van eiwitten waarva…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
Referencias
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
- Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
- Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
- Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
- Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
- Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
- Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
- Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
- Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
- Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
- Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
- Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
- Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
- Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
- Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
- Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
- Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
- Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
- Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
- Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
- Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
- Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
- Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
- Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
- Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
- Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
- Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
- Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
- Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
- Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
- Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
- Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
- Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
- Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
- Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
- Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2′-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).
