Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

Summary

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Abstract

Los centrosomas son pequeñas pero importantes orgánulos que sirven como los polos del huso mitótico para mantener la integridad genómica o ensamblar cilios primarios para facilitar las funciones sensoriales en las células. El nivel de una proteína puede ser regulada de manera diferente en los centrosomas que en otros lugares .cellular, y la variación en el nivel centrosomal de varias proteínas en diferentes puntos del ciclo celular parece ser crucial para la adecuada regulación de montaje centríolo. Hemos desarrollado un ensayo de microscopía de fluorescencia cuantitativa que mide los cambios relativos en el nivel de una proteína en los centrosomas en células fijadas de diferentes muestras, tales como en las diferentes fases del ciclo celular o después del tratamiento con varios reactivos. El principio de este ensayo radica en la medición de la intensidad fluorescente con corrección de fondo correspondiente a una proteína en una pequeña región, y normalizar que la medición contra el mismo para otra proteína que no varía bajo la c experimental elegidoondition. Utilizando este ensayo en combinación con pulso de BrdU y la estrategia de persecución para estudiar ciclos celulares no perturbadas, hemos validado cuantitativamente nuestra reciente observación de que la piscina centrosomal de VDAC3 está regulada a centrosomas durante el ciclo celular, probablemente por la degradación mediada por proteasoma específicamente a los centrosomas.

Introduction

Los centrosomas consisten en un par de centriolos rodeados por el material pericentriolar (PCM). Siendo los principales centros organizadores de microtúbulos (COMT) en células de mamíferos, los centrosomas actúan como los dos polos de husos mitóticos en células en división, y por lo tanto ayudan a mantener la integridad genómica ^1. En las células quiescentes (por ejemplo, durante la fase G0), uno de los dos centriolos del centrosoma, a saber, el centríolo madre, se transforma en un cuerpo basal de montar el cilio primario, un orgánulo sensorial que sobresale hacia fuera de la superficie de la célula ^2. Una vez que las células vuelvan a entrar en el ciclo celular, los cilios primarios se desmonta y cada centríolo dirige el montaje de un procentriole en su extremo proximal que se alarga gradualmente para formar un centríolo madura ^3. En el inicio de la fase S, una estructura de rueda de carro como que proporciona la simetría 9 veces a la centriolo se forma sobre la superficie de cada centríolo existente y se convertirá en la base de cada procentriole. SAS6 tsombrero es indispensable para el montaje es reclutado centríolo para formar el eje de la rueda de carro ^4-6. Otras proteínas centriolares se ensamblan en la rueda de carro en un muy regulado, proximal a distal manera ^7. Después de completar con precisión la duplicación centríolo, las células se ensamblan materiales pericentriolar adicionales para construir dos centrosomas funcionales para el final de la fase G2 ^8. Además de los componentes básicos centriolares ^9-11, varias otras proteínas, incluyendo quinasas, fosfatasas, chaperones, los componentes de andamios, proteínas de membrana asociados y maquinaria degradación están asociados con centríolos, cuerpos basales y PCM en diferentes momentos del ciclo celular ^12-16. A menudo se observó que los niveles centrosomales de muchas proteínas están temporalmente regulados por mecanismos de focalización centrosomales y / o la degradación proteasomal en centrosomas. Es importante destacar que las fluctuaciones en el nivel centrosomal de varias proteínas tales como PLK4, Mps1, SAS6, y CP110 unat diferentes puntos del ciclo celular parece ser crucial para regular el montaje centriolo ^5,17-22, y en el caso de Mps1 la prevención de esta degradación centrosomal conduce a la formación de un exceso de ¹⁹ centríolos. Por otra parte, las fracciones centrosomales de varias proteínas son menos lábiles en comparación con piscinas citosólicas. Por ejemplo siRNA mediada baja regulación de Centrin 2 (Cetn2) llevó a sólo una disminución moderada del nivel de proteína en los centríolos pesar de la gran reducción en sus niveles de células enteras ^23. Por tanto, es crucial para medir los cambios en el nivel de proteínas centrosomales en el centrosoma en lugar de medir el conjunto de los niveles de proteína celular al evaluar sus funciones centrosoma específico.

En este estudio, hemos desarrollado un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para cuantificar el nivel relativo de una proteína en los centrosomas. Este ensayo se desarrolló especialmente para analizar células que son de diferentes muestrasy por lo tanto no puede ser reflejado al mismo tiempo. Estas muestras pueden ser células que fueron tratados con diferentes reactivos (es decir, las drogas versus control), recogidas en diferentes puntos de tiempo (es decir, el pulso frente a la persecución), o están en diferentes fases del ciclo celular. El principio de este ensayo radica en la medición de la intensidad fluorescente con corrección de fondo correspondiente a una proteína en una pequeña región y para normalizar dicho valor contra el mismo para otra proteína cuyos niveles no varían en las condiciones experimentales elegidas. Varios estudios en la biología del centrosoma han utilizado recientemente varias técnicas de microscopía cuantitativa, tanto en células vivas o fijas, para determinar la función del centrosoma específica de proteínas candidatas ^24-27. Similares a los ensayos, la presente técnica también mide la corrección de fondo intensidad de fluorescencia de la proteína de prueba. Sin embargo, la inclusión de la normalización utilizando un patrón interno en este ensayo probablemente ofrecería mayorprecisión y confianza en el análisis de dos muestras diferentes que se encuentran en dos cubreobjetos diferentes. Por otra parte, además de examinar el nivel de proteína en los centrosomas, con ajustes menores este método se puede aplicar a un conjunto diverso de condiciones experimentales o en otros sitios celulares.

Aquí, combinamos nuestro ensayo microscopía cuantitativa con una estrategia de pulso y persecución BrdU para comparar las células de las etapas del ciclo celular diferentes. En lugar de utilizar técnicas de detención del ciclo celular estándar y de liberación para estudiar diversos puntos de tiempo del ciclo celular, las células que crecen de forma asíncrona se incuban con BrdU para marcar las células en la fase S, y las células marcadas son perseguidos durante diversos tiempos (normalmente 4-6 horas). La mayoría de las células marcadas estarán en la fase S inmediatamente después del pulso. La longitud de la persecución se elige de manera que después de la caza, las células marcadas serán a finales de S, G2, o mitosis, que puede ser verificado por las características morfológicas, de posición AS- de centrosomas con respecto a nucLei, distancia entre los centrosomas, la condensación de cromosomas, etc. Por lo tanto, la longitud de la persecución depende de la duración media de S, G2 y la fase M de un tipo de célula particular. Dado que este enfoque evita inhibidores del ciclo celular, tales como hidroxiurea, afidicolina, nocodazol, etc., permite un análisis más fisiológicamente relevantes del ciclo celular.

Por lo tanto, aquí demostrar que el ensayo de microscopía de fluorescencia cuantitativa solo, o en combinación con BrdU ensayo de pulso-caza, es una técnica simple pero potente para medir con precisión los cambios relativos en el nivel de una proteína centrosomal candidato durante un ciclo celular imperturbable. Se midió el nivel de centrosomal VDAC3, una proteína que se identificó recientemente en los centrosomas, además de las mitocondrias ^16,28, el uso de estos ensayos. Los resultados obtenidos aquí verificar nuestra observación anterior de que la piscina centrosomal de VDAC3 está regulada por la degradación, y también varía en un dependen del ciclo celulart forma ^16, además, la validación de la aplicabilidad de este método.

Protocol

1. Cultivo Celular Utilice la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), las células epiteliales del pigmento de la retina inmortalizadas (hTERT-RPE1; se hace referencia aquí como RPE1). NOTA: RPE1 células son células humanas diploides, casi no transformadas que se utilizan comúnmente para estudiar el montaje centriolo y ciliogenesis. Estas células siguen un ciclo normal de duplicación centriolo coordinado con un ciclo celular regulado. Passage un casi confluente 100 mm placa de …

Representative Results

Nuestros estudios recientes identificaron novela localización centrosomal y la función de VDAC3, una de las porinas mitocondriales 16,28. La inmunotinción de varias células de mamíferos que incluyen células RPE1 utilizando un anticuerpo VDAC3 específica mostró prominente tinción centrosomal y comparativamente débil tinción mitocondrial. También demostramos que VDAC3 centrosomal se asocia preferentemente con el centríolo madre, y la piscina centrosomal tanto de la endógena y expresó ectópica VD…

Discussion

Microscopía cuantitativa en biología celular se asocia comúnmente con los ensayos de formación de imágenes de células vivas, como Energía de Resonancia Fluorescente Transfer (FRET), la fluorescencia de recuperación después de photobleaching (FRAP), etc. Sin embargo, hay cada vez más ejemplos de los biólogos celulares en desarrollo diferentes ensayos de microscopía cuantitativos para fijo las células en los últimos años ^27,34-36. Es importante destacar que, el progreso en la comprensió…

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Fibronectin	Sigma	F8141	Stock of 1 mg/ml in water
DMSO	Sigma	D2650
MG115	Sigma	SCP0005	Stock of 10 mM in DMSO
BrdU	Sigma	B5002	Stock of 10 mM in DMSO
Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)	Sigma	T 6557	1:200 in IIF blocking buffer
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)	Aviva Systems Biology	ARP35180-P050	1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)	Santa cruz biotechnology	sc-81431	1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)	Abcam	ab-75005	1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)	Abcam	ab6326	1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Life technologies	A21093	1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21202	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21203	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21206	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21207	1:1000 in IIF blocking buffer
Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)	Sigma	T5192	1:1000 in WB blocking buffer
Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)	Sigma	T9026	1:20000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Life technologies	A10043	1:10000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated	Rockland antibodies	610-731-002	1:10000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent	Life technologies	S36936	Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1	Fisherbrand	12-545-80
Olympus IX-81 microscope	Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera	QImaging	32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective	Olympus		1.4 numerical aperture
Slidebook software package	Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System	Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay	Thermo Scientific	23227
U-MNU2 Narrow UV cube	Olympus	U-M622	Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube	Olympus	U-M643	Filter
U-MNU2 Narrow Green cube	Olympus	U-M663	Filter