정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해
Summary
Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.
Abstract
중심체는 게놈 무결성을 유지 또는 세포에서 감각 기능을 용이하게하기 위해 차 섬모를 조립하는 유사 분열 스핀들의 기둥 역할을 작지만 중요한 소기관이다. 단백질의 수준은 다른 위치들에서보다 .cellular 중심체에서 다르게 조절 될 수 있고, 세포주기의 여러 다른 지점에서의 centrosomal 단백질 레벨의 변화는 중심 소체 조립체의 적절한 조절에 중요한 것으로 보인다. 우리는 세포주기의 다른 단계에서와 같은 각종 시약으로 처리 한 후 다른 샘플들로부터 고정 된 세포 중심체에서 단백질의 상대 수준의 변화를 측정하는 정량적 형광 현미경 분석법을 개발 하였다. 이 분석의 원리는 소 영역에서의 단백질에 대응하는 배경 보정 된 형광 강도를 측정에 놓여, 및 선택된 실험 C 하에서 변하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 측정을 정상화 그ondition. BrdU의 펄스와 교란 세포주기를 연구 추격 전략과 함께이 분석을 활용하여, 우리는 정량적으로 특별히 중심체에서 프로 테아 좀 중재 저하에 의해 가능성이 VDAC3의 centrosomal 풀 세포주기 동안 중심체에서 규제되고 우리의 최근의 관찰을 검증했다.
Introduction
중심체는 pericentriolar 물질 (PCM)으로 둘러싸인 중심 소체의 쌍으로 구성되어 있습니다. 포유 동물 세포의 주요 미세 소관 조직 센터 (MTOCs)이기 때문에, 중심체는 분할 세포에서 유사 분열 스핀들의 두 기둥 역할을하고, 따라서 게놈 무결성 1을 유지하는 데 도움이. (G0 단계에서 예) 대기 세포에서, 중심체, 즉 머더 중심 소체의 두 중심 소체 중 하나는 일차 섬모, 세포 표면 (2)로부터 돌출 감각 소기관 조립 기부 본체로 변형된다. 일단 세포가 세포주기를 다시 입력 일차 섬모 분해하여 각 중심 소체 서서히 성숙한 중심 소체 (3)을 형성하는 그것의 신장 기단부 procentriole의 조립을 지시한다. S 단계의 개시시에 중심 소체 9 대칭성을 제공 수레 바퀴 형 구조는 기존의 각 중심 소체의 표면에 형성되고, 각각의베이스 procentriole해질 것이다. Sas6의 t중심 소체 조립체 4-6 수레 바퀴의 중심을 형성하기 위해 채용되는 모자 불가결하다. 다른 centriolar 단백질은 말초 방식으로 7 엄격한 규제, 근위부의 수레 바퀴에 조립된다. 정확하게 중심 소체 중복을 완료 한 후, 세포를 G2 단계 (8)의 단부가 두 기능 중심체를 구축하는 추가 물질 pericentriolar 조립한다. 핵심 centriolar 구성 요소 9-11, 키나제, 포스, 보호자, 비계 구성 요소, 멤브레인 관련 단백질 분해 기계 등 여러 가지 다른 단백질뿐만 아니라 세포주기 12-16의 서로 다른 시간에 중심 소체, 기저 기관 및 PCM과 연결되어 있습니다. 그것은 종종 많은 단백질의 centrosomal 레벨이 일시적으로 centrosomal 타겟팅 메커니즘 및 / 또는 중심체에서 프로 테오 저하에 의해 규제된다는 점에 유의한다. 중요한 것은, 이러한 PLK4, Mps1, Sas6 및 CP110의 여러 단백질의 centrosomal 수준의 변동세포주기 t의 상이한 점은 중심 소체 조립체 5,17-22을 조절하는 것이 중요 할 것처럼,이 열화를 방지 centrosomal Mps1의 경우에 과량의 중심 소체 (19)의 형성을 이끈다. 한편, 여러 가지 단백질의 세포질 분획 centrosomal 풀에 비해 덜 불안정하다. 예를 들어 하향 조절 Centrin 2 (Cetn2)의 매개 된 siRNA는 그 전체 셀 레벨 (23)에서 큰 감소에도 불구 중심 소체에서 단백질의 수준이 적당하게 감소되었다. 오히려 그들의 중심체 특정 기능을 평가할 때 전 세포 단백질 수준을 측정하는 것보다 중심체에서 centrosomal 단백질 수준에서의 변화를 측정하는 것이 중요하다.
본 연구에서 우리는 중심체에서 단백질의 상대적인 수준을 정량화하는 간접 면역 형광 (IIF)를 사용하여 분석을 개발 하였다. 이 분석은 다른 샘플로부터 아르 세포를 분석하는데 특히 개발따라서 동시에 묘화 될 수 없다. 이들 샘플은 상이한 시점에서 수집 된 다른 시약 (즉, 약물 대 제어) 처리 한 세포가 될 수있다 (즉, 체이스 대 펄스) 또는 세포주기의 상이한 위상에있다. 이 분석의 원리는 배경 형광 강도 보정 소 영역에서 단백질에 대응하고, 그 레벨 선택 실험 조건에서 변화하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 값이 정상화 측정에있다. 중심체 생물학의 여러 연구는 최근에 후보 단백질 24 ~ 27의 중심체 고유의 기능을 결정하기 위해, 모두 라이브 또는 고정 세포에서 다양한 정량적 현미경 기술을 활용했다. 이러한 분석과 유사하게, 본 기술은 또한 시험 단백질의 백그라운드 보정 된 형광 강도를 측정한다. 그러나,이 분석에서 내부 표준을 사용하여 정규화 포함될 가능성이 큰 것이라고 알려정확성과 커버 슬립 상에 두 개의 서로 다른 두 개의 서로 다른 시료를 분석의 신뢰도. 또한, 중심체의 단백질 수준을 조사 이외에 약간의 조정으로이 방법은 실험 조건의 다양한 세트 또는 다른 부위에서 세포에 적용될 수있다.
여기서 우리는 다른 세포주기 단계에서 세포를 비교하는 BrdU의 펄스 체이스 전략과 우리의 양적 현미경 분석을 결합한다. 대신에, 다양한 세포주기 시점 공부 비동기식 성장하는 세포를 표준 세포주기 정지 및 해제 방법을 사용하는 S 단계에서 세포를 라벨 BrdU를 배양하고, 표지화 된 세포는 다양한 시간 (전형적으로 4-6 시간) 미국 쫓기는. 표지 된 세포의 대부분은 즉시 펄스 후 S 상에있을 것입니다. 체이스 후, 표지 된 세포는 형태 학적 특성 NUC에 대한 중심체의 이러한 된 직후 위치하여 확인할 수 있습니다 늦게 S, G2, 또는 유사 분열에 될 수 있도록 체이스의 길이는 선택레이, 중심체 사이 거리 등의 염색체 축합 따라서, 추적의 길이를 S, G2 및 특정 세포 유형의 M상의 평균 지속 기간에 의존한다. 이 접근법 등 히드 록시, aphidicolin, nocodazole 같은 세포주기 억제제를 방지하기 때문에, 더욱 중요한 생리 학적 세포주기 분석을 허용한다.
따라서, 우리는 단독 정량적 형광 현미경 분석법 또는 BrdU의 펄스 – 체이스 분석과 조합하여, 정확하게 섭동 세포주기 동안 후보 단백질 centrosomal 수준의 상대적인 변화를 측정하기위한 간단하지만 강력한 방법 인 것은 여기에서 설명한다. 우리는이 어 세이를 이용하여, VDAC3, 우리가 최근 16, 28을 미토콘드리아에 부가 중심체에서 식별 centrosomal 단백질 수준을 측정 하였다. 여기에서 얻어진 결과 VDAC3의 centrosomal 풀 저하에 의해 규제되는 우리의 이전의 관찰을 확인하고 또한 세포주기 dependen에 변화t 방식 (16)은 또한이 방법의 적용 성을 검증.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포 생물학의 양적 현미경은 일반적으로 고정 된 다른 양적 현미경 분석을 개발하고 세포 생물학의 성장 사례가있다, 그러나 등 (FRAP) 광표백 후 같은 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 형광 복구와 같은 라이브 세포 이미징 분석과 연관된 최근 몇 년 동안 27,34-36 세포. 중요한 것은, 중심체 생물학을 이해 진행은 종종 centrosomal 풀을 다른 풀과 다르게 조절 될 수있다 단백질의 중심체 특?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
Referencias
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