Количественный иммунофлюоресценции для измерения различий в уровне белка на центросомах

Summary

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Abstract

Центросомах небольшие, но важные органеллы, которые служат в качестве полюсов митотического веретена для поддержания геномной целостности или собирают первичные реснички, чтобы облегчить сенсорные функции в клетках. Уровень белка может регулироваться по-разному в центросомах, чем в других местах .cellular, а изменение в центросомного уровне нескольких белков в различных точках клеточного цикла, как представляется, имеет решающее значение для надлежащего регулирования центриолей сборки. Мы разработали количественный анализ флуоресцентной микроскопии, который измеряет относительные изменения в уровне белка на центросомах в фиксированных клеток из различных образцов, например, в различных фазах клеточного цикла или после обработки различными реагентами. Принцип этого теста заключается в измерении фона исправлены интенсивность флуоресценции, соответствующую белку в небольшой области, и нормализуют что измерение по сравнению с аналогичным по другим белком, который не меняется в соответствии с выбранным экспериментальным Condition. Используя этот анализ в сочетании с BrdU импульса и стратегии погони изучения невозмущенных клеточных циклов, мы количественно подтверждено наше наблюдение, что в последнее время центросомных пул VDAC3 регулируется на центросомах во время клеточного цикла, скорее всего, от протеасомы-опосредованной деградации конкретно на центросомах.

Introduction

Центросомах состоят из пары центриолей, окруженных pericentriolar материала (ИКМ). Будучи основным микротрубочек организующих центров (MTOCs) в клетках млекопитающих, Центросомы служить как два полюса митотических веретен в делящихся клетках, и, таким образом, помогают поддерживать геномную целостность ^1. В покоящихся клетках (например, при G0 фаза), один из двух центриолей центросомы, а именно материнской центриоли, превращается в базальной тела, чтобы собрать первичную ресничку, сенсорный органеллы, выступающий из клеточной поверхности ^2. После того, как клетки повторно ввести в клеточный цикл, первичной реснички разобранном и каждый центриоль направляет сборку procentriole на ее проксимальном конце, который постепенно удлиняется с образованием зрелого центриоль ^3. В начале S-фазы, колесом, как структура, которая обеспечивает 9-кратной симметрии к центриоли образуется на поверхности каждой существующей центриоли и станет основой каждого procentriole. Sas6 тшляпа является необходимым условием для центриоль сборка на работу, чтобы сформировать ступицу колесом ^4-6. Другие центриолярных белки затем собираются на колесом в очень регулируется, проксимальнее дистальной образом ^7. После точно завершения центриоли дублирования, клетки собрать дополнительные pericentriolar материалы, чтобы построить две функциональные центросомами к концу фазе G2 ^8. В дополнение к основным центриолярных компонентов ^9-11, несколько других белков, включая киназы, фосфатазы, сопровождающих, компонентов строительных лесов, мембранные, связанных белков и деградации техники связаны с центриолей, базальных тел и PCM в разное время клеточного цикла ^12-16. Часто отмечается, что центросомной уровни многих белков временно регулируются центросомных механизмов обеспечения адресности и / или деградации протеосомной на центросомах. Важно отметить, что колебания в центросомной уровне нескольких белков, таких как Plk4, Mps1, Sas6 и CP110 ат различные точки клеточного цикла, как представляется, важно, чтобы регулировать центриоль узел ^5,17-22, а в случае Mps1 предотвращения этого центросомных деградации приводит к образованию избыточных центриолями ^19. С другой стороны, центросомных фракции нескольких белков менее лабильным сравнению с цитозольных бассейнов. Например миРНК опосредованного вниз регулирования ЦентрИН 2 (Cetn2) привело к лишь умеренное снижение уровня белка в центриолей, несмотря на сильное снижение во всем его уровням клеток ^23. Поэтому очень важно, чтобы измерить изменения в уровне центросомных белков на центросома, а не измерения целые уровни белка клеток при оценке их центросомой определенные функции.

В этом исследовании мы разработали анализ с использованием непрямой иммунофлюоресценции (IIF) для количественной оценки относительного уровня белка в центросомах. Этот анализ разработан особенно для анализа клеток, которые из разных образцови, таким образом, не могут быть отображены одновременно. Эти образцы могут быть клетки, которые обрабатывали различными реагентами (например, препарат по сравнению с контролем), собранных в различные моменты времени (то есть, по сравнению с импульсным погоне), или находятся в различных фазах клеточного цикла. Принцип этого теста заключается в измерении фона исправлены интенсивность флуоресценции, соответствующую белку в небольшой области и нормализовать это значение по сравнению с аналогичным по другим белком, уровни не изменяются при выбранных условиях эксперимента. Несколько исследований в биологии центросом недавно использованы различные количественные методы микроскопии, в обоих живых или фиксированных клеток, чтобы определить, центросоме-специфической функции белков-кандидатов ^24-27. Как и в этих анализах, настоящая методика также измеряет фона исправлены интенсивности флуоресценции исследуемого белка. Тем не менее, включение нормализации с использованием внутреннего стандарта в этом анализе будет скорее всего больше предложитьточность и уверенность в анализе двух различных образцов, которые находятся на двух разных покровные. Кроме того, в дополнение к рассмотрении уровня белка в центросомах, с незначительными изменениями этот метод может быть применен к разнообразным набором экспериментальных условиях или в других клеточных сайтов.

Здесь мы объединим наши количественные микроскопии анализа со стратегией импульса погони BrdU сравнить клетки от различных стадий клеточного цикла. Вместо того, чтобы, используя стандартные ареста и освобождения клеточного цикла методы, чтобы изучить различные моменты времени клеточного цикла, асинхронно растущих клеток инкубируют с BrdU, чтобы маркировать клетки в S-фазе, и меченые клетки преследовали в течение различного времени (как правило, 4-6 ч). Большинство из меченых клеток будет в S-фазе непосредственно после импульса. Длина погоне выбрана так, что после того, как в погоне, меченые клетки будут в конце S, G2, или митоза, которые могут быть проверены с помощью морфологических характеристик, таких AS-положении центросомах по отношению к NUCлей, расстояние между центросомах, конденсации хромосом и т.д. Таким образом, длина погоне зависит от средней продолжительности S, G2 и M фазе конкретного типа клеток. Так как этот подход позволяет избежать ингибиторы клеточного цикла, такие как гидроксимочевина, aphidicolin, нокодазолом и т.д., что позволяет более физиологически значимого анализа клеточного цикла.

Таким образом, мы демонстрируем, что количественный флуоресцентной микроскопии в одиночку анализ, или в сочетании с BrdU импульса погони анализа, является простой, но мощный метод для точного измерения относительных изменений в центросомной уровня белка-кандидата во время невозмущенной клеточного цикла. Мы измерили центросомной уровень VDAC3, белка, который мы недавно были определены на центросомах в дополнение к митохондриях ^16,28, используя эти анализы. Результаты, полученные здесь, проверить наш предыдущее замечание, что центросомной бассейн VDAC3 регулируется деградации, а также меняется в dependen клеточного циклат манера ^16, кроме того, проверки применимости этого метода.

Protocol

1. Культура клеток Используйте теломеразы человека обратной транскриптазы (hTERT) увековечил эпителиальных пигментных клеток сетчатки (hTERT-RPE1; именуемый здесь RPE1). ПРИМЕЧАНИЕ: RPE1 клетки почти диплоидные, без культурах трансформированных клеток человека, которые обычно использу?…

Representative Results

Наши недавние исследования выявили новый центросомной локализацию и функцию VDAC3, один из митохондриальных поринов 16,28. Иммуноокрашивание нескольких клетках млекопитающих, включая RPE1 клеток с использованием VDAC3-специфические антитела показали заметную центросомной окрашивание…

Discussion

Количественный микроскопии в клеточной биологии обычно ассоциируется с анализами изображений живых клеток, таких как флуоресцентного резонанса передачи энергии (FRET), флуоресцентная Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP), и т.д. Однако, там растут примеры клеточных биолого?…

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Fibronectin	Sigma	F8141	Stock of 1 mg/ml in water
DMSO	Sigma	D2650
MG115	Sigma	SCP0005	Stock of 10 mM in DMSO
BrdU	Sigma	B5002	Stock of 10 mM in DMSO
Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)	Sigma	T 6557	1:200 in IIF blocking buffer
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)	Aviva Systems Biology	ARP35180-P050	1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)	Santa cruz biotechnology	sc-81431	1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)	Abcam	ab-75005	1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)	Abcam	ab6326	1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Life technologies	A21093	1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21202	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21203	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21206	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21207	1:1000 in IIF blocking buffer
Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)	Sigma	T5192	1:1000 in WB blocking buffer
Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)	Sigma	T9026	1:20000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Life technologies	A10043	1:10000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated	Rockland antibodies	610-731-002	1:10000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent	Life technologies	S36936	Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1	Fisherbrand	12-545-80
Olympus IX-81 microscope	Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera	QImaging	32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective	Olympus		1.4 numerical aperture
Slidebook software package	Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System	Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay	Thermo Scientific	23227
U-MNU2 Narrow UV cube	Olympus	U-M622	Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube	Olympus	U-M643	Filter
U-MNU2 Narrow Green cube	Olympus	U-M663	Filter