بسيط Multiwell تصلب الفحص لدراسة الردود خلية تصلب التي تعتمد على أساس بولي أكريلاميد
Summary
Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Abstract
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Introduction
معظم الأنسجة في الجسم هي المواد اللزجة لينة مع معامل يونج (أ) تتراوح من 0.1 كيلو باسكال لالدماغ إلى 100 كيلو باسكال لالغضاريف لينة، وبعد، ويجري أكثر في أبحاث الخلايا المختبر على البوليسترين زراعة الأنسجة (TCP) التي لديها معامل ~ 1 جيغا 1 عدم التطابق هذا صلابة يؤثر بشكل كبير على طريقة الخلايا تستجيب لبيئتها. وهناك مجموعة متزايدة من البحوث بالتالي مخصص لتوضيح تأثير الركيزة صلابة على مصير مختلف أنواع الخلايا، بما في ذلك 2،3 الخلايا الجذعية. 4 ونتيجة لذلك، تم وضع الهلاميات المائية متعددة للمساعدة في فهم خلية تعتمد على صلابة علم الأحياء بما في ذلك بولي أكريلاميد (PA) و5-7 البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، 8،9 ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS)، و 10 والجينات. 11 في حين أن الأدلة التي الركيزة صلابة لديها تأثير كبير على مصير الخلايا ينمو، ويتم إجراء معظم الدراسات على نطاق ضيق مع عدد صغير من الصورةamples. منهجية، ودراسات متعددة الأبعاد على تأثير الركيزة صلابة لمجموعة من أنواع الخلايا أو الظروف البيئية نادرة. 12
وقد تم تطوير العديد من التقنيات هيدروجيل عالية الإنتاجية الواعدة، بما في ذلك ميكروأرس تستند PEG، 13 ميكروفلويديك الأجهزة لإنتاج ميكروبيدات الاغاروز هيدروجيل، 14 أو الجزئي والنانو قضبان حيث التضمين صلابة من قبل قطر والارتفاع من microrods. 15 ولكن وتكنولوجيات إعداد مثل هذه ركائز هي متطورة والمتاحة لعدد محدود من المختبرات. الكثير من البحوث التي تنطوي على صلابة التضمين استجابات الخلايا يستخدم بولي أكريلاميد (PA) المواد الهلامية التي ليست فقط غير مكلفة وبسيطة لتنفيذ، ولكن أيضا يحمل مجموعة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من معامل يونج، وهي 0.3 – 300 كيلو باسكال 16-22 ومع ذلك، الأساليب القائمة لافتعال PA المواد الهلامية للثقافة الخلية هي كثيفة العمالة وبالتالي الإعداديةعرب كورب في دفعات صغيرة. بعض الصعوبات المرتبطة إعداد المواد الهلامية السلطة الفلسطينية بمثابة ركائز الخلايا الجذعية من شرط أن المواد الهلامية يجب أن يكون مستعدا: 1) في غياب الأكسجين للسماح البلمرة كاملة، 2) مع سطح مستو وناعم للسماح خلية موحدة المرفقات ونشر، و3) الملصقة بشكل دائم إلى أسفل الطبق الثقافة الخلية لمنع العائمة.
وقد حاولت عدة مجموعات لإنتاج المواد الهلامية السلطة الفلسطينية لزراعة الخلايا على دفعات كبيرة. زملر وآخرون أوراق سميكة مستعدة من المواد الهلامية السلطة الفلسطينية التي كانت ثم "قطع" مع لكمة ثقب وضعها في لوحات 96-جيدا. 23 ومع ذلك، هذا الأسلوب يقتصر على المواد الهلامية أشد، أي> 1 كيلو باسكال في معامل يونج، ليونة المواد الهلامية هي "لزجة"، من الصعب قطع، وتلف بسهولة. MIH وآخرون بتطوير تقنية أكثر تطورا والذي يسمح المواد الهلامية ليتم بلمرة مباشرة في لوحة من الزجاج السفلي multiwell. <sتصل> 6 وقد تحقق ذلك عن طريق سكب الحلول هلام في لوحات من الزجاج السفلي بين functionalized وتشكيل المواد الهلامية التي كتبها "يقحم" لهم مع مجموعة ساترة مخصصة. و6 على الرغم من واعدة جدا، والآثار تفوق طفيف لا يزال لوحظ مع هذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب هذه التقنية مجموعة مصمم خصيصا لا يمكن الوصول إليها على الفور إلى العديد من المختبرات وكذلك من الزجاج السفلي مكلفة لوحات multiwell.
وتصف هذه الورقة طريقة بسيطة وغير مكلفة لتجميع المواد الهلامية للسلطة الفلسطينية في لوحة multiwell التي يمكن اعتمادها بسهولة من قبل أي مختبر. هنا، ويستخدم على الدعم من البلاستيك المرن الذي له وجهان – واحد مسعور، وهو طارد للالهلام السلطة الفلسطينية، واحد ماء، الذي يربط تساهميا هلام السلطة الفلسطينية على الترسيب. مرة واحدة يتم إيداع أوراق هلام السلطة الفلسطينية وبشكل دائم الملصقة على الدعم من البلاستيك المرن، فإنه يمكن التعامل مع المواد الهلامية من أي سمك أو تصلب وقطع لهم في أي شكل المطلوب. هذا approach تنتج ليس فقط مخصصة "coverslips" بلاستيكية بأحجام لا خلاف المتاحة تجاريا، ولكن أيضا يغني عن ضرورة إلى ما قبل علاج الواجهات الزجاجية، إما coverslips الزجاج أو الآبار من الزجاج السفلي مكلفة لوحات multiwell، مع حل السلطة الفلسطينية ملزم، وهو ومملة وخطوة تستغرق وقتا طويلا. وأخيرا، وصحائف والمواد الهلامية PA موحدة يمكن أن تكون على استعداد في دفعات كبيرة وتخزينها دي رطب لعدة أشهر.
وباختصار، فإن فحص المقدمة هنا هو تحسنا الطرق القائمة في عدة جوانب. أولا، عملية لوحة التجمع multiwell هي كفاءة، والتكلفة الإجمالية للمواد المطلوبة منخفضة. ثانيا، يتم إنتاج الهلاميات المائية في دفعات كبيرة في فيلم هلام متجانس واحد. وأخيرا، يطلب من المواد فقط التي هي متاحة تجاريا. وتتجلى فائدة الفحص من خلال استكشاف تأثير الركيزة صلابة على مورفولوجيا الخلايا ونشر المنطقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
المواد الهلامية بولي أكريلاميد، وضعت أصلا لالكهربي، 28 تستخدم الآن بشكل روتيني بمثابة ركائز ثقافة الخلية لدراسة آثار الركيزة صلابة على مورفولوجيا الخلايا، حركية، والاتصالات 3،24،29 بين خصائص الخلايا الأخرى. بولي أكريلاميد يسمح التلاعب الركيزة صلابة ليشم?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Materials
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |
Referencias
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
- Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
- Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
- Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
- Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
- Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
- Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
- Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino … [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Lo, C. -. M., Wang, H. -. B., Dembo, M., Wang, Y. -. l. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. l. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
- Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918 (2010).
- Chrambach, A. . The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
- Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
- Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
- Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
- Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
- Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).
