Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule
Summary
Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Abstract
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Introduction
La maggior parte dei tessuti del corpo sono materiali viscoelastici morbidi con un modulo di Young che vanno da 0,1 kPa per cervello a 100 kPa per cartilagine morbida, ma, più de ricerca sulle cellule vitro è condotta su coltura tissutale polistirene (TCP), che ha un modulo di ~ 1 GPa . 1 Questa mancata corrispondenza rigidità influenza notevolmente il modo in cui le cellule rispondono al loro ambiente. Un crescente corpo di ricerca è quindi dedicata alla chiarire l'effetto del substrato rigidità sul destino di vari tipi cellulari, comprese le cellule staminali 2,3. 4 Come risultato, più idrogel sono stati sviluppati per aiutare nella comprensione della cella rigidità-dipendente biologia compresi poliacrilammide (PA), 5-7 polietilene glicole (PEG), 8,9 polidimetilsilossano (PDMS), 10 e alginato. 11 Mentre la prova che substrato rigidità ha un impatto sostanziale sul destino delle cellule è in crescita, la maggior parte degli studi sono condotti su scala ridotta con un piccolo numero di samples. Sistematiche, studi multidimensionali sull'effetto di substrato rigidità per una serie di tipi cellulari o condizioni ambientali sono rare. 12
Sono state sviluppate diverse tecnologie idrogel high-throughput promettenti, tra cui microarrays basati PEG, 13 dispositivi microfluidici per la produzione di microsfere di agarosio idrogel, 14 o micro e nano-aste in cui la rigidità è modulata dal diametro e altezza delle microrods. 15 Tuttavia , le tecnologie per preparare questi substrati sono sofisticati e disponibili per il numero limitato di laboratori. Gran parte della ricerca che coinvolge rigidità modulato le risposte delle cellule utilizza poliacrilammide (PA) gel che non sono solo poco costoso e semplice da implementare, ma mostrano anche una gamma fisiologicamente rilevanti di modulo di Young, vale a dire 0,3 -. 300 kPa 16-22 Tuttavia, i metodi esistenti per fabbricare PA gel per colture cellulari molto lavoro e, conseguentemente, di preparazioneared in piccoli lotti. Alcune delle difficoltà associate alla preparazione di gel PA come substrati cellulari derivano dal requisito che i gel devono essere preparati: 1) in assenza di ossigeno per permettere la completa polimerizzazione, 2) con una superficie piana e liscia per consentire cellulare uniforme attaccamento e diffusione, e 3) fissata in modo al fondo del piatto di coltura cellulare per prevenire galleggiante.
Diversi gruppi hanno tentato di produrre gel PA per colture cellulari in grandi lotti. Semler et al. Fogli spessi preparati dei gel PA che erano poi "tagliata" con un perforatore e posizionati in piastre da 96 pozzetti. 23 Tuttavia, questo metodo è limitato a gel rigide, cioè,> 1 kPa nel modulo di Young, perchè più morbido gel sono "sticky", difficile da tagliare, e facilmente danneggiati. Mih et al. Sviluppato una tecnica più sofisticata che permette i gel da polimerizzare direttamente in una piastra multipozzetto fondo di vetro. <sup> 6 Questo è stato ottenuto versando le soluzioni di gel in lastre di vetro-bottom funzionalizzate e formando gel da "sandwich" di loro con un allineamento coprioggetti personalizzato. 6 Anche se, lievi effetti di bordo molto promettenti sono stati ancora osservati con questa tecnica. Inoltre, la tecnica richiede una matrice custom-designed non immediatamente accessibili a molti laboratori e costose piastre a pozzetti multipli con fondo di vetro.
Questo documento descrive un modo semplice e poco costoso da montare gel PA in una piastra multipozzetto che potrebbe facilmente essere adottata da qualsiasi laboratorio. Qui, un supporto plastico flessibile è utilizzato, che ha due lati – uno idrofoba, che è repellente per gel PA, e uno idrofila, che si lega covalentemente il gel PA sulla deposizione. Una volta fogli di gel PA vengono depositati e permanentemente affissa al supporto plastico flessibile, consente la movimentazione gel di qualsiasi spessore o rigidità e taglio in qualsiasi forma desiderata. Questo approach non solo produce custom 'vetrini' di plastica in formati non altrimenti disponibili in commercio, ma evita anche la necessità di pre-trattare le superfici di vetro, sia vetrini o pozzetti di costose lastre di pozzetti con fondo di vetro, con una soluzione PA vincolante, che è un noioso e un passo che richiede tempo. Infine, uniformi fogli gel PA possono essere preparati in grandi lotti e de-idratato conservati per alcuni mesi.
In sintesi, il saggio qui presentato è un miglioramento rispetto ai metodi esistenti in diversi aspetti. In primo luogo, il processo di assemblaggio piastra multipozzetto è efficiente, e il costo complessivo dei materiali necessari è basso. In secondo luogo, gli idrogel sono prodotte in grandi lotti in un unico film gel omogeneo. Infine, solo materiali che sono commercialmente disponibili sono richiesti. L'utilità del saggio è illustrato esplorare l'effetto di substrato rigidità sulla morfologia cellulare e zona diffusione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gel di poliacrilammide, originariamente sviluppati per elettroforesi, 28 sono oggi utilizzati di routine come substrati di coltura cellulare per studiare gli effetti di substrato rigidità sulla morfologia delle cellule, la motilità e la comunicazione 3,24,29 tra le altre caratteristiche cellulari. Poliacrilammide consente la manipolazione del substrato rigidità che comprende la rigidità di tutti i tessuti molli del corpo (0,3 – 300 kPa) 1 con una semplice variazione della concentrazi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Materials
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |
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