Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-
Summary
Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Abstract
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Introduction
La mayoría de los tejidos en el cuerpo son materiales viscoelásticos suaves con un módulo de Young que varía de 0,1 kPa para el cerebro a 100 kPa para el cartílago suave, sin embargo, la mayoría es la investigación de células in vitro se lleva a cabo en poliestireno de cultivo de tejido (TCP), que tiene un módulo de ~ 1 GPa . 1 Este desajuste rigidez afecta en gran medida la forma en las células responden a su medio ambiente. Un cuerpo creciente de investigación es, pues, dedicada a elucidar el efecto de la rigidez del sustrato sobre el destino de diversos tipos de células, incluidas las células madre 2,3. 4 Como resultado, múltiples hidrogeles han sido desarrollados para ayudar en la comprensión de la célula de rigidez dependiente biología incluyendo poliacrilamida (PA), 5-7 polietilenglicol (PEG), 8,9 polidimetilsiloxano (PDMS), 10 y alginato. 11 Mientras que la evidencia de que la rigidez del sustrato tiene un impacto sustancial en el destino celular está creciendo, se llevan a cabo en la mayoría de los estudios una pequeña escala con un pequeño número de sejemplos. Los estudios sistemáticos, multidimensionales sobre el efecto de la rigidez del sustrato para una gran variedad de tipos de células o las condiciones ambientales son raros. 12
Varias tecnologías de hidrogel de alto rendimiento prometedores se han desarrollado, incluyendo microarrays basados en PEG, 13 dispositivos de microfluidos para la producción de microperlas de agarosa de hidrogel, 14 o micro y nano-barras, donde la rigidez es modulada por el diámetro y la altura de los los micro. 15 Sin embargo , las tecnologías de la preparación de dichos sustratos son sofisticados y disponible para un número limitado de laboratorios. Mucha investigación que implica rigidez modulada respuestas de células utiliza poliacrilamida (PA) geles que no sólo son de bajo costo y simple de implementar, sino también exhibir una gama fisiológicamente relevante del módulo de Young, es decir, 0,3 -. 300 kPa 16-22 Sin embargo, los métodos existentes para fabricar PA geles para el cultivo celular son mano de obra intensiva y, en consecuencia prepared en pequeños lotes. Algunas de las dificultades asociadas con la preparación de geles PA como sustratos de células madre a partir de la exigencia de que los geles tienen que estar preparados: 1) en ausencia de oxígeno para permitir la polimerización completa, 2) con una superficie plana y lisa para permitir celular uniforme apego y difusión, y 3) fijado de forma permanente a la parte inferior de la placa de cultivo celular para prevenir flotante.
Varios grupos han intentado producir geles PA para el cultivo de células en grandes lotes. Semler et al. Láminas gruesas preparados de geles PA que fueron luego "cortada" con un punzón y se colocaron en placas de 96 pocillos. 23 Sin embargo, este método está limitado a geles más rígidos, es decir,> 1 kPa en el módulo de Young, ya que más suave geles son "pegajosos", difícil de cortar, y se dañan fácilmente. Mih et al. Desarrolló una técnica más sofisticada que permite a los geles a polimerizar directamente en una placa de múltiples pocillos con fondo de cristal. <sarriba> 6 Esto se logró mediante el vertido de las soluciones de gel en placas con fondo de vidrio funcionalizadas y formar geles por "sandwich" con una matriz cubreobjetos personalizado. 6 A pesar de que, los efectos de borde ligeras muy prometedores todavía se observaron con esta técnica. Además, la técnica requiere una matriz de diseño personalizado no inmediatamente accesible a muchos laboratorios, así como costosas placas de múltiples pocillos con fondo de cristal.
Este documento describe una manera sencilla y económica de montar geles PA en una placa de múltiples pocillos que podría ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio. Aquí, se utiliza un soporte de plástico flexible, que tiene dos lados – un uno hidrofóbico, que es repelente a los geles PA, y uno hidrofílico, que se une covalentemente el gel de PA sobre la deposición. Una vez láminas de gel de PA se depositan y permanentemente fijada en el soporte de plástico flexible, permite un manejo geles de cualquier grosor o rigidez y cortarlos en cualquier forma deseada. Este aproach no sólo produce personalizados '' cubreobjetos de plástico en tamaños no disponibles comercialmente, sino que también elimina la necesidad de las superficies de vidrio-tratamiento previo, ya sea cubreobjetos de vidrio o los pozos de las costosas placas de múltiples pocillos con fondo de cristal, con una solución PA vinculante, que es un tedioso y un paso de tiempo. Por último, las hojas de geles PA uniformes se pueden preparar en grandes lotes y se almacenaron-de hidratado durante varios meses.
En resumen, el ensayo que aquí se presenta es una mejora sobre los métodos existentes en varios aspectos. En primer lugar, el proceso de montaje de placa de pocillos múltiples, es eficiente, y el coste global de los materiales requeridos es baja. En segundo lugar, los hidrogeles se producen en grandes lotes en una única película de gel homogénea. Finalmente, sólo se requieren materiales que están disponibles comercialmente. La utilidad del ensayo se ilustra por explorar el efecto de la rigidez del sustrato sobre la morfología celular y el área de difusión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geles de poliacrilamida, desarrollados originalmente para la electroforesis, 28 ahora se utilizan rutinariamente como sustratos de cultivo celular para estudiar los efectos de la rigidez del sustrato sobre la morfología celular, la motilidad y la comunicación 3,24,29 entre otras características de las células. Poliacrilamida permite la manipulación de la rigidez del sustrato para abarcar la rigidez de los tejidos blandos del cuerpo (0,3 a 300 kPa) 1 con un simple cambio en la concen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Materials
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |
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