Simples Multiwell Rigidez Ensaio para o Estudo das respostas das células Rigidez dependentes base de poliacrilamida

Summary

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Abstract

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Introduction

A maioria dos tecidos do corpo são materiais viscoelásticos moles com um módulo de Young na gama de 0,1 kPa para o cérebro a 100 kPa durante cartilagem mole, ainda, a maior parte da investigação de células in vitro é realizada em culturas de tecidos de poliestireno (TCP), que tem um módulo de ~ 1 GPa . ¹ Esse descompasso rigidez afeta significativamente a forma como as células respondem ao seu meio ambiente. Um crescente corpo de pesquisa é, assim, dedicado a elucidar o efeito de rigidez do substrato sobre o destino de vários tipos de células, incluindo células estaminais ^{2,3 4} Como resultado., Vários hidrogéis têm sido desenvolvidos para auxiliar no entendimento de células dependente de rigidez biologia incluindo poliacrilamida (PA), ^5-7 polietileno glicol (PEG), ^8,9 polidimetilsiloxano (PDMS), ¹⁰ e ^{11 de} alginato. Embora a evidência de que a rigidez substrato tem um impacto substancial sobre o destino celular está crescendo, a maioria dos estudos são realizados em uma pequena escala com um pequeno número de samples. Multidimensionais, estudos sistemáticos sobre o efeito da rigidez substrato para uma variedade de tipos de células ou condições ambientais são raros. ¹²

Várias tecnologias de hidrogel de alto rendimento promissoras foram desenvolvidas, incluindo microarranjos baseados em PEG, ¹³ dispositivos microfluídicos para a produção de microesferas de agarose de hidrogel, ¹⁴ ou micro e nano-hastes onde rigidez é modulada pelo diâmetro e altura das microrods. ¹⁵ No entanto , as tecnologias para preparar tais substratos são sofisticados e disponível para um número limitado de laboratórios. Muita pesquisa envolvendo rigidez modulado respostas das células utiliza poliacrilamida (PA) géis que não só são baratos e simples de implementar, mas também exibem uma gama fisiologicamente relevante de módulo de Young, a saber, 0,3 -. 300 kPa ^16-22 No entanto, os métodos existentes para fabricar PA géis para cultura de células são intensivos de trabalho e, consequentemente, prepared em pequenos lotes. Algumas das dificuldades associadas com a preparação de géis PA como substratos de células-tronco a partir da exigência de que os géis tem que estar preparado: 1) na ausência de oxigênio para permitir a polimerização completa, 2) com uma superfície plana e lisa para permitir a célula uniforme ligação e de espalhamento, e 3) fixada permanentemente na parte inferior da placa de cultura de células para prevenir flutuação.

Diversos grupos tentaram produzir géis PA para cultura de células em grandes lotes. Semler et al., Folhas de espessura preparados de géis de PA, que foram depois "cortado" com um furador e colocadas em placas de 96 poços. ²³ No entanto, este método está limitado a géis mais duras, ou seja,> 1 kPa no módulo de Young, porque mais suave géis são "pegajoso", difícil de cortar, e facilmente danificada. Mih et ai. Desenvolveram uma técnica mais sofisticado que permite que os géis a ser polimerizado directamente em uma placa com múltiplas cavidades com fundo de vidro. <sup> 6 Isto foi conseguido através de derramamento as soluções de gel em placas com fundo de vidro funcionalizados e formando géis por "imprensando-los" com uma matriz lamela personalizado. ⁶ embora muito promissores, efeitos ligeira vantagem ainda foram observados com esta técnica. Além disso, a técnica requer uma matriz de design personalizado não imediatamente acessível para muitos laboratórios, bem como placas com múltiplas cavidades com fundo de vidro caros.

Este artigo descreve uma maneira simples e barata para montar géis PA em um prato com vários poços que poderiam ser facilmente adotado por qualquer laboratório. Aqui, um suporte de plástico flexível é utilizado, que tem dois lados – um um hidrofóbico, que é repelente para géis de PA, e um uma hidrofílica, que liga covalentemente o gel PA sobre deposição. Uma vez que as folhas de gel de PA são depositados e permanentemente fixo ao suporte de plástico flexível, que permite manipular géis de qualquer espessura ou rigidez e cortando-os em qualquer forma desejada. Este aproxoach não só produz personalizados lamelas '' plásticas em tamanhos não anteriormente disponíveis no mercado, mas também elimina a necessidade de superfícies de vidro-tratamento pré, quer lamelas de vidro ou os poços de placas de múltiplos poços com fundo de vidro caros, com uma solução de ligação PA, que é uma tediosa e um passo consumidor de tempo. Finalmente, as folhas de geles uniformes PA pode ser preparado em grandes lotes e armazenados de-hidratado durante vários meses.

Em resumo, o ensaio aqui apresentado constitui uma melhoria em relação aos métodos existentes em vários aspectos. Em primeiro lugar, o processo de montagem de placa de poços múltiplos é eficaz, e o custo global dos materiais necessários é baixo. Em segundo lugar, os hidrogéis são produzidas em grandes lotes de um único filme em gel homogénea. Finalmente, apenas os materiais que se encontram comercialmente disponíveis são necessários. A utilidade do ensaio é ilustrada a explorar o efeito da rigidez do substrato na morfologia celular e a área de difusão.

Protocol

1. Preparação de Soluções de Hidrogel Alíquotas e associadas Preparação da solução precursora de gel de poliacrilamida. Preparar solução precursora em gel de poliacrilamida através da mistura de acrilamida (A) (40% w / v, M r 71,08 g / mol), a bisacrilamida reticulador (B) (2% w / v, r M 154,17 g / mol), e de- água ionizada nos percentuais de volume especificados na Tabela 1. NOTA: Estas soluções podem ser preparadas em grandes lotes e guar…

Representative Results

Poliacrilamida (PA) hidrogéis são amplamente usadas para testar as respostas celulares dependentes de rigidez. 17,24 por mistura de várias concentrações de acrilamida (A) e bis-acrilamida (B) pode-se fazer géis PA que abrangem a gama de rigidez da maioria dos tecidos moles em o corpo – 0,3 -.. 300 módulo de kPa Jovem 1 No entanto, a preparação de géis de poliacrilamida é tedioso e demorado, muitas vezes limitando a sua utilidade em aplicações "high-throughput", como para a se…

Discussion

Geles de poliacrilamida, originalmente desenvolvidos para electroforese, ²⁸ são rotineiramente utilizados como substratos de cultura celular para estudar os efeitos de rigidez do substrato sobre a morfologia celular, motilidade, ^3,24,29 e comunicação entre outras características celulares. Poliacrilamida permite a manipulação de rigidez do substrato para abranger a rigidez de todos os tecidos moles do corpo (0,3-300 kPa) ¹ com uma simples mudança na concentração de precursor de …

Materials

Reagents
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL	BD Biosciences	354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Hydrophobic solution – Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Detergent – Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit	Chemicon International	ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
15 mL Conicals	FALCON	352097
Micro centrifuge tubes	Fisher Scinetific	2 mL: 02681258
96-well plate (flat bottom)	Fisher Scinetific	12565501
Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM	PM992
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven	UVITRON	UV1080
Vacuum chamber/degasser	BelArt	999320237
Vacuum pump for degasser	KNF Lab	5097482
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Hemacytometer	Bright-Line	383684