Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi
Summary
Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Abstract
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Introduction
Vücutta en dokular ~ 1 GPa arasında bir elastisite modülüne sahiptir 0.1 kPa ila yumuşak kıkırdağın 100 kPa beyin, ancak, in vitro hücre araştırmalarında es doku kültür polistiren (TCP) üzerinde gerçekleştirilmiştir arasında değişen bir Young modülüne sahip yumuşak viskoelastik malzemelerdir . 1 Bu sertlik uyumsuzluğu ölçüde hücreler çevrelerine cevap şeklini etkiler. Araştırma artan vücut, 2,3 kök hücreler de dahil olmak üzere. Bunun sonucunda 4 farklı hücre tiplerinin kaderi üzerinde tabaka sertlik etkisi açıklık böylece adanmış, birden hidrojeller sertlik-bağımlı hücre anlaşılmasına yardım için geliştirilmiştir Yüzey sertliği hücre kaderi üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu kanıtlar büyürken poliakrilamidin (PA), 5-7 polietilen glikol (PEG), 8,9 polidimetilsiloksan (PDMS), 10 ve aljinat içeren biyoloji. 11, en çalışmalar yürütülmektedir s az sayıda küçük ölçekliörnekleri şunlardır:. Hücre tipleri veya çevresel koşullar nadir bir dizi için substrat sertlik etkisi sistematik, çok boyutlu çalışmalar. 12
Çok ümit vaat eden yüksek verimli hidrojel teknolojisi PEG-bazlı microarrays, sertlik microrods çapı ve yüksekliği ile modüle edilen agaroz hidrojel mikro, 14 ya da mikro ve nano çubuklar üretim için 13 mikroakışkan cihazlar da dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. 15 Ancak , teknolojileri, yüzeyler sofistike ve laboratuvarların sınırlı sayıda mevcuttur hazırlamak. Sertliği modüle hücre yanıtları kapsayan pek çok araştırma uygulanması, aynı zamanda Young'ın modülü, yani 0.3 fizyolojik olarak uygun bir aralığı gösteren sadece ucuz ve basit değildir, poliakrilamid (PA) jelleri kullanan -. 300 kPa 16-22 Ancak, PA imalatı için yöntem Mevcut Hücre kültürü için jeller, emek yoğun ve dolayısıyla hazırlık vardırKüçük gruplar halinde ared. Hücre alt-tabakalar olarak PA jellerin hazırlanması ile ilgili zorluklardan bazıları jeller hazırlanacak olması şartı kaynaklanmaktadır: 1) oksijen yokluğunda tam polimerizasyona olanak sağlamak için, 2), düz ve pürüzsüz bir yüzeye sahip tek tip hücre olanak sağlamak üzere eki ve yayma, ve 3) kalıcı yüzen önlemek için hücre kültürü çanak altına yapıştırılmıştır.
Çeşitli gruplar, büyük gruplar halinde hücre kültürü için PA jeller üretmek için çalıştılar. Semler ve diğ., Bir delikli zımba ile daha sonra "kesme" ve 96 oyuklu plakalara yerleştirildi PA jeller hazırlanmış kalın levhalar. 23 Bununla birlikte, bu yöntem, katı jeller, örneğin,> 1 kPa bir Young modülü de, yumuşak, çünkü sınırlıdır jeller, kesmek zor, ve kolayca zarar "yapışkan" bulunmaktadır. MIH ve diğ., Jeller, doğrudan bir cam alt oyuklu bir plaka içinde polimerize edilmesini sağlar, daha gelişmiş bir teknik geliştirdi. <skadar> 6 Bu fonksiyonlaşmış cam alt tabak içine jel çözümleri dökme ve özel coverglass dizi ile "sandviç" tarafından jeller oluşturarak elde edildi. 6 olsa çok umut verici, hafif kenar etkileri hala bu teknikle gözlendi. Ayrıca, teknik, birçok laboratuvarlar yanı sıra pahalı cam alt çukurlu plakalara hemen erişilebilir bir özel tasarlanmış bir dizi gerektirir.
Bu kağıt kolayca herhangi bir laboratuar tarafından kabul edilebilir bir multiwell plaka PA jeller araya için basit ve ucuz bir şekilde anlatılmaktadır. Itici PA jeller olan bir hidrofobik on, ve kovalent birikmesi üzerine PA jel bağlayan hidrofil bir on, – Burada, esnek bir plastik destek iki tarafı sahip olan kullanılır. PA jel yaprak esnek plastik bir desteğe tespit sürekli yatırılır ve sonra, herhangi bir kalınlığı ya da sertlik jeller kullanım ve arzu edilen herhangi bir şekil olarak kesilmesi mümkün kılar. Bu yakloach bir PA bağlayıcı çözelti ile, cam lamelleri ya da pahalı cam alt çukurlu plakaların kuyu ya aksi takdirde piyasada mevcut değil boyutlarda özel plastik 'lamelleri' üreten, aynı zamanda cam yüzeyler-tedavi öncesi gerekliliğini ortadan kaldırır sadece sıkıcı ve zaman alıcı bir adım. Son olarak, tek tip PA jeli yaprak büyük partiler halinde hazırlandı ve birkaç ay süreyle de hidratlanmamış saklanabilir.
Özetle, burada sunulan tahlil çeşitli yönleriyle mevcut yöntemlere göre bir gelişmedir. İlk olarak, çok oyuklu bir plaka montaj işlemi verimli ve gerekli malzemelerin toplam maliyeti düşüktür. İkinci olarak, hidrojeller tek bir homojen jel, film içinde büyük partiler halinde üretilmektedir. Son olarak, ticari olarak temin edilebilir, yalnızca malzeme gerekmektedir. Analizin yarar hücre morfolojisi üzerinde alt-tabaka sertliğinin etkisinin incelenmesi ve alan yayılması ile görüntülenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başlangıçta elektroforez için geliştirilen Poliakrilamid jeller, 28 şimdi rutin hücre morfolojisi, hareketliliği ve diğer hücre özellikleri arasındaki iletişimi 3,24,29 tarihinde substrat sertlik etkilerini incelemek için hücre kültürü substrat olarak kullanılır. (Şekil 2, Tablo 1 'de referans 17,25,26 bakınız) polimer ön-madde konsantrasyonu basit bir değişiklikle – (300 kPa 0.3) 1 Poliakrilamid alt-tabaka sertliğinin manipülas…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Materials
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |
Referencias
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
- Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
- Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
- Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
- Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
- Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
- Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
- Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino … [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Lo, C. -. M., Wang, H. -. B., Dembo, M., Wang, Y. -. l. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. l. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
- Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918 (2010).
- Chrambach, A. . The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
- Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
- Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
- Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
- Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
- Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).
