Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten
Summary
Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Abstract
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Introduction
Die meisten Gewebe im Körper weich sind viskoelastische Materialien mit einem Young-Modul im Bereich von 0,1 kPa für Gehirn bis 100 kPa für weiche Knorpel, doch sind die meisten in vitro Zellforschung auf Gewebekulturpolystyrol (TCP) durchgeführt, die einen Modul von ~ 1 GPa hat . 1 Diese Steifigkeit Mismatch großen Einfluss auf die Art und Weise Zellen reagieren auf ihre Umwelt. Eine wachsende Zahl von Untersuchungen ist somit gewidmet Erläuterung der Wirkung des Substrats Steifigkeit auf das Schicksal verschiedener Zelltypen, 2,3 einschließlich Stammzellen. 4 Als Ergebnis wurden mehrere Hydrogele entwickelt worden, um das Verständnis der steifigkeitsabhängigen Zell helfen Biologie einschließlich Polyacrylamid (PA), 5-7 Polyethylenglykol (PEG) 8,9 Polydimethylsiloxan (PDMS), 10 und Alginat. 11 Während der Beweis, dass das Substrat Steifigkeit hat einen wesentlichen Einfluss auf das Schicksal der Zelle wächst, die meisten Untersuchungen auf geführt in kleinem Maßstab mit einer kleinen Anzahl von sBeispiele. Systematische, mehrdimensionalen Studien über die Wirkung der Substrat Steifigkeit für eine Reihe von Zelltypen oder Umweltbedingungen selten. 12
Einige vielversprechende Hochdurch Hydrogel Technologien wurden entwickelt, einschließlich PEG-Microarrays, 13 mikrofluidischen Vorrichtungen zur Herstellung von Agarose Hydrogelmikroperlen, 14 oder Mikro- und Nanostäbe denen Steifigkeit wird durch den Durchmesser und die Höhe der Mikrostäbchen moduliert. 15. Jedoch , die Technologien zur Herstellung solcher Substrate sind anspruchsvoll und für eine begrenzte Anzahl von Laboratorien. Viel Forschung an Steifigkeit moduliert Zell-Reaktionen nutzt Polyacrylamid (PA) Gele, die nicht nur preiswert und einfach zu implementieren, aber auch zeigen einen physiologisch relevanten Bereich des E-Moduls, nämlich 0,3 liegen. – 300 kPa 16 bis 22 jedoch bestehende Methoden zu PA herzustellen Gele für die Zellkultur sind arbeitsintensiv und damit prepin kleinen Chargen ared. Einige der Schwierigkeiten, die mit der Herstellung von PA-Gelen als Zellsubstrate zugeordnet ergeben sich aus der Forderung, daß die Gele hergestellt werden müssen: 1) in Abwesenheit von Sauerstoff, um eine vollständige Polymerisation zu ermöglichen, 2) mit einer flachen und glatten Oberfläche, um eine einheitliche Zell ermöglichen Befestigung und Ausbreitung, und 3) fest auf dem Boden der Zellkulturschale Aufschwimmen verhindern befestigt.
Mehrere Gruppen haben versucht, PA-Gele für die Zellkultur in großen Stückzahlen zu produzieren. Semler et al. Vorbereiteten dicken Folien aus PA-Gelen, die dann einen "Schnitt" waren mit einem Locher und in 96-Well-Platten gegeben. 23. Dieses Verfahren ist jedoch begrenzt auf steifer Gele, dh> 1 kPa im Elastizitätsmodul, da weichere Gele sind "sticky", schwierig zu schneiden und leicht beschädigt. Mih et al. Entwickelten eine ausgefeiltere Technik, die Gele direkt in einem Glasbodenmultiwellplatte polymerisiert werden können. <sbis> 6 Dies erfolgte, indem die Gel-Lösungen in funktionalisierte Glasbodenplatten und Bildung von Gelen von "sandwichartig" sie mit einem benutzerdefinierten Deckglas Array erreicht. 6 Obwohl vielversprechend, leichte Randeffekte waren noch mit dieser Technik beobachtet. Zusätzlich wird die Technik erfordert eine maßgeschneiderte Array nicht unmittelbar zugänglich vielen Labors als auch kostspielige Glasbodenmultiwellplatten.
Dieser Aufsatz beschreibt eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, PA-Gelen in einer Multiwellplatte, die leicht von jedem Labor angenommen werden könnte zubauen. Hierbei wird eine flexible Kunststoffunterlage verwendet wird, welches zwei Seiten hat – ein hydrophobes, die abweisend zu PA-Gelen, und einem hydrophilen eine, an das kovalent das PA-Gel bei der Abscheidung. Sobald PA Gelfolien abgeschieden und dauerhaft mit dem flexiblen Kunststoffträger befestigt sind, ermöglicht es der Handhabung Gele beliebiger Dicke oder Steifigkeit und schneidet sie in jede gewünschte Form. Diese ca.oach erzeugt nicht nur individuelle Kunststoff 'Deck' in Größen im Handel nicht erhältlich, sondern auch beseitigt die Notwendigkeit, Glasoberflächen-treat vorab entweder Glasplättchen oder die Vertiefungen der teuren Glasboden-Mikrotiterplatten mit einer PA-Bindungslösung, welche ist eine mühsame und zeitraubenden Schritt. Schließlich kann eine gleichmäßige PA Gele Blätter in großen Stückzahlen hergestellt und gelagert de-hydrierten mehrere Monate werden.
Zusammenfassend ist der Assay hier vorgestellt ist eine Verbesserung gegenüber bestehenden Verfahren in mehrfacher Hinsicht. Erstens ist der Prozeß der Vielmuldenplatten-Anordnung effizient, und die Gesamtkosten der benötigten Materialien ist gering. Zweitens werden die Hydrogele in großen Chargen in einem einzigen homogenen Gelfilm hergestellt. Schließlich werden nur Materialien, die im Handel erhältlich sind erforderlich. Die Nützlichkeit des Assays wird durch die Erforschung der Wirkung des Substrats Steifigkeit auf die Zellmorphologie und die Ausbreitungsfläche dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polyacrylamid-Gele, die ursprünglich für die Elektrophorese entwickelten, 28 werden nun routinemßig als Zellkultursubstrate verwendet werden, um die Auswirkungen von Substrat Steifigkeit auf die Zellmorphologie, Motilität und Kommunikations 3,24,29 unter anderem Zelleigenschaften zu untersuchen. Polyacrylamid ermöglicht die Bearbeitung der Substratsteifigkeit um die Steifigkeit aller Weichteile im Körper umfassen (0,3 bis 300 kPa) 1 mit einer einfachen Änderung der Polymervorstufe…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Materials
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |
Referencias
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