Synthèse de thermogélifiant Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtine Composites Sulfate avec Alginate Microparticules pour le génie tissulaire
Summary
Un injectable échafaudage d'ingénierie tissulaire composé de poly (N-isopropylacrylamide) de sulfate -graft-chondroïtine (PNIPAAm-g-CS) contenant des microparticules d'alginate a été préparé. La force d'adhérence, des propriétés de gonflement et de biocompatibilité in vitro sont analysés dans cette étude. Les techniques de caractérisation développés ici peuvent être applicables à d'autres systèmes thermogélifiants.
Abstract
Biomatériaux injectables sont définis comme des matériaux implantables qui peuvent être introduites dans le corps à l'état liquide et se solidifient in situ. Ces matériaux offrent les avantages cliniques d'être implanté minimalement effractive et facilement former des solides de remplissage de l'espace dans les défauts de forme irrégulière. biomatériaux injectables ont été largement étudiés comme échafauds pour l'ingénierie tissulaire. Cependant, pour la réparation de certaines zones de support de charge dans le corps, tel que le disque intervertébral, échafauds doivent posséder des propriétés adhésives. Cela permettrait de minimiser le risque de dislocation pendant le mouvement et assurer un contact intime avec le tissu environnant, assurant la transmission adéquate des forces. Ici, nous décrivons la préparation et la caractérisation d'un échafaudage composé thermiquement poly sensibles (N-isopropylacrylamide) sulfate -graft-chondroïtine (PNIPAAm-g-CS) et des microparticules d'alginate. Le copolymère PNIPAAm-g-CS forme une solution visqueuse dans l'eau à température ambiante, dans laquelle alginatparticules e sont suspendues pour améliorer l'adhérence. Au-dessus de la température de solution critique inférieure (LCST), environ 30 ° C, le copolymère se forme un gel solide autour des microparticules. Nous avons adapté les procédures biomatériaux de caractérisation standard pour tenir compte de la transition de phase réversible de PNIPAAm-g-CS. Les résultats indiquent que l'incorporation d'/ ml de particules d'alginate de 50 ou 75 mg à 5% (p / v) les solutions PNIPAAm-g-CS quadrupler la force d'adhérence à la traction-PNIPAAm GCS seul (p <0,05). L'incorporation de microparticules d'alginate augmente également de manière significative la capacité de gonflement de PNIPAAm-g-CS (p <0,05), permettant de maintenir un gel de remplissage d'espace à l'intérieur des défauts tissulaires. Enfin, les résultats de la toxicologie in vitro kit de dosage dans le 2,3-bis (2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl) -2H-tétrazolium-5-carboxanilide (XTT) et dosage de la viabilité Vivant / Mort indiquent que le l'adhésif est capable de supporter la survie et la prolifération des encapsulé de rein embryonnaire humain (HEK) 293 caunes sur 5 jours.
Introduction
Biomatériaux injectables sont ceux qui peuvent être commodément administré dans le corps sous forme liquide et se solidifie in situ. De tels matériaux ont été largement appliquée dans la médecine régénératrice, où ils sont utilisés pour délivrer des cellules encapsulées au niveau du site affecté 1-4 et agir comme une matrice extracellulaire provisoire en trois dimensions pour les cellules 5. Pour le patient, les biomatériaux injectables sont avantageux parce que les procédures chirurgicales pour l'implantation sont peu invasive et la phase solide peut remplir de forme irrégulière défauts des tissus, ce qui élimine la nécessité pour les implants de taille personnalisée.
Injectabilité peut être réalisée par une variété de mécanismes. Les facteurs externes, comme le pH, ont été étudiés comme un déclencheur pour la formation de gels qui encapsulent les cellules et molécules bioactives 6-8. Cependant, le pH peut ne pas être le déclencheur le plus pratique à utiliser dans tous les environnements physiologiques. Une autre alterna traditionnelletive pour atteindre injectabilité utilise polymérisation in situ chimique ou réticulation dans. Un groupe a développé un système rédox soluble dans l'eau constitué de persulfate d'ammonium et de N, N, N -tétraméthyléthylènediamine ', N' et l'a utilisé pour faire réagir macromères composé de polyéthylène glycol et de poly (propylène) glycol 9,10. Zan et al. 11 réseaux chitosane d'alcool polyvinylique injectables développés réticulés avec le glutaraldéhyde. Dans ces systèmes, la cytotoxicité des composés réactifs doit être envisagée, en particulier pour des applications impliquant l'encapsulation cellulaire. En outre, la polymérisation exothermique pourrait produire des températures suffisamment élevées pour compromettre les tissus environnants, ce qui a été rapporté pour l' os polymère ciments 12,13.
Encore d'autres systèmes polymères injectables ont été mises au point qui présentent un changement de liquide à l'état solide avec la température comme le déclencheur. Connu sous le nom de systèmes thermogélifiants, ce sont aqueonous solutions de polymères qui ne nécessitent pas de stimulation chimique, des monomères réticulants, ou pour obtenir la formation in situ 14. Au contraire, une transition de phase se produisant habituellement proche de la température physiologique induit la formation d'un réseau tridimensionnel réticulé physiquement. Poloxamères tels que Pluronic F127 sont parmi les polymères les plus étudiés pour thermogélifiant délivrance de médicaments 15-17 et cellulaire encapsulation 18,19. Toutefois, il est bien admis que ces gels manquent de stabilité dans des conditions physiologiques. Des études ont démontré une stabilité accrue à l' aide d' allongement de chaîne 20 ou réticulants chimiques 21,22. Néanmoins, l'utilisation de ces réactifs peut limiter le potentiel des matériaux pour l'encapsulation des cellules.
Poly (N-isopropylacrylamide) est un polymère thermogélifiant synthétique qui a reçu beaucoup d' attention dans l' ingénierie tissulaire et la délivrance des médicaments 14. des solutions aqueuses de poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) présentent une température de solution critique inférieure (LCST), se produisant typiquement autour de 32-34 ° C 23,24. En dessous de la LCST, l'eau hydrate les chaînes PNIPAAm. Au- dessus de la température de transition, le polymère devient hydrophobe, ce qui entraîne une séparation de phase dramatique 25-27 et la formation d'un gel solide sans l'utilisation de monomères réticulants ou toxiques. Cependant, les homopolymères PNIPAAm présentent des propriétés élastiques pauvres et détiennent peu d' eau à la température physiologique en raison de l' hydrophobie 28. Dans ce travail, nous avons choisi d'intégrer de manière covalente le sulfate de chondroïtine dans le réseau PNIPAAm, qui offre le potentiel de dégradabilité enzymatique 29, l' activité anti-inflammatoire 30,31, et l' eau a augmenté et l' absorption des nutriments 32. les copolymères PNIPAAm avec CS ont été préparés dans notre laboratoire par polymérisation du monomère NIPAAm en présence de méthacrylate fonctionnalisé CS pour former un copolymère greffé (PNIPAAm-g-CS). Because de la densité de réticulation faible du copolymère, PNIPAAm-g-CS forme une solution visqueuse dans l' eau à la température ambiante et un gel élastique à la température physiologique , en raison de la LCST 29. Les solutions de polymère deviennent coulante à nouveau lors du refroidissement au-dessous de la LCST du fait de la réversibilité de la transition.
Nous avons démontré que PNIPAAm-g-CS est susceptible de fonctionner comme un échafaudage d'ingénierie tissulaire, en raison des propriétés mécaniques qui peuvent être adaptées, la dégradabilité et la cytocompatibilité avec des cellules de rein embryonnaire humain (HEK) 293 29 cellules. Cependant, dans certaines zones de support de charge, tels que le disque intervertébral, le tissu des échafaudages d'ingénierie doivent avoir la capacité de former une interface sensible avec le tissu environnant de disque afin d' éliminer le risque de luxation 33. Cette interface est également nécessaire pour la transmission adéquate de la force à travers l'interface entre l'implant et le tissu 33. Dans notre travail, nous avons suspendu unlginate microparticules dans des solutions aqueuses de PNIPAAm-g-CS et a constaté que les microparticules se localise gélification, qui assurent l' adhérence avec le tissu 34 environnant. Dans cet article, nous présentons les étapes de préparation du thermogélifiant, polymère adhésif. Des techniques standard pour la caractérisation de biomatériaux, d'imagerie cellulaire, et des essais de viabilité ont été adaptées pour tenir compte de la sensibilité à la température du polymère et la réversibilité de la transition de phase. Le polymère injectable décrit dans le présent document a une large potentiel pour des applications de distribution de médicaments et de l'ingénierie tissulaire en dehors de ceux décrits dans le présent document. En outre, les méthodes de caractérisation décrites ici peuvent être applicables à d'autres systèmes thermogélifiants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a plusieurs étapes critiques dans la synthèse du composite hydrogel microparticule et d'évaluer sa force adhésive, gonflement capacité, et la biocompatibilité cellulaire. polymérisation radicalaire d'PNIPAAm-g-CS nécessite méthacrylation réussie du sulfate de chondroïtine, la dissolution complète des composants monomères et les conditions de réaction exempt d'oxygène. Le rapport du monomère au NIPAAm méthacrylé chondroïtine sulfate dans le mélange réactionnel a été choisi parce qu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier l'aide du Dr Jennifer Kadlowec dans le développement du protocole d'essai de traction adhésif.
La recherche rapportée dans la présente publication a été appuyée par l'Institut national de l'arthrite et de l'appareil locomoteur et des maladies de la peau et l'Institut national d'imagerie biomédicale et Bioengineering des National Institutes of Health sous Award Numéro 1R15 AR 063920-01. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
| Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
| Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
| 50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
| Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
| Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
| Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
| Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
| Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
| 70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
| DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
| Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
| Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
| Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
| Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
| XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
| Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
| Dulbecco's PBS: 1X | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
| Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
| Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips |
| No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
| Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
| Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
| Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 mL |
| FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
| Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
| Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
| Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
| 2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
| E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
| Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
| Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
| Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
| Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
| Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37°C | |
| Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
| Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
| Rocking platform | VWR | Series 100 | |
| Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
| Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
| Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |
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