조직 공학 알긴산 미세 입자와 Thermogelling 폴리 (N- 이소 프로필) -graft - 콘드로이틴 황산 복합 재료의 합성
Summary
폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드) – -graft 콘드로이틴 설페이트 이루어지는 주사 조직 공학적 지지체는 (PNIPAAm-g-CS) 함유 알긴산 미립자를 제조 하였다. 속성 및 생체 적합성 시험 관내에서 팽윤 접착력은 본 연구에서 분석된다. 여기서 개발 된 특성화 기술 thermogelling 다른 시스템들에 적용 할 수있다.
Abstract
주사 생체 물질은 액체로 몸에 도입하고 현장에서 응고 될 수 이식 물질로 정의된다. 이러한 물질은 최소 침습적으로 쉽게 불규칙 모양의 결함에 공간을 채우는 고체를 형성 이식되는 임상 적 이점을 제공합니다. 주사 생체 재료 널리 조직 공학을위한 발판으로 조사되었다. 그러나 본문에 특정로드 베어링 영역의 수리를 들면, 추간판로, 비계는 접착 성을 소유해야합니다. 이 힘의 적절한 전송을 제공하는 운동 중에 전위의 위험을 최소화하고 주변 조직에 밀착되도록한다. 여기, 우리는 열에 민감한 폴리 (N- 이소 프로필)로 이루어진 지지체의 제조 및 특성 -graft – 콘드로이틴 황산 (PNIPAAM-g-CS) 및 알지네이트 미세 입자를 설명합니다. PNIPAAm-g-CS 공중 합체 alginat로 RT 중의 점성 용액을 형성즉 입자의 밀착성을 향상시키기 위해 정지된다. 30 ° C의 주위 하부 임계 용액 온도 (LCST) 위의 공중 합체 미립자 주위에 단단한 겔을 형성한다. 우리는 계정에 PNIPAAm-g-CS의 가역적 상전이을 표준 생체 재료 특성화 절차를 적용했다. 결과는 5 %로 50 또는 75 ㎎ / ㎖ 알긴산 입자의 혼입 (/ w를 V) PNIPAAm-g-CS 용액 단독 PNIPAAm-GCS의 접착 인장 강도 (p <0.05) 네 배로 것을 나타낸다. 알지네이트 미세 입자의 결합도 크게 조직 결함 내에서 공간을 채우는 젤을 유지하는 데 도움 PNIPAAm-g-CS의 붓기 용량 (P <0.05) 증가한다. 마지막으로, 2,3- 비스 관내 독성 분석 키트의 결과 (2- 메 톡시 -4- 니트로 -5- 술포 페닐) -2H- 테트라 졸륨 -5- carboxanilide (XTT) 및 라이브 / 죽은 생존력 분석법는 것을 나타 접착제 생존 캡슐화 인간 배아 신장 증식을 지원할 수있다 (HEK) 293 C오일 이상 ELL 학생.
Introduction
주사 가능한 생체 물질 편리 액체로 체내에 전달 반응계에서 고화 될 수들이다. 이러한 물질은이 셀 (5)을위한 3 차원 임시 외 기질로서 해당 사이트 1-4 행위 캡슐화 세포 전달하기 위해 사용되는 재생 의료에 광범위하게 적용되고있다. 주입 수술 절차와 최소 침습있는 고상 불규칙 정의 크기 임플란트에 대한 필요성을 제거, 조직 결손 형 채울 수 있기 때문에 환자의 경우, 주사 가능한 생체 물질이 유리하다.
입성는 다양한 메커니즘을 통해 달성 될 수있다. 외부 요인은 pH를 원한다면, 세포 및 생체 활성 분자를 캡슐화 6-8 겔의 형성을위한 트리거로 조사되었다. 그러나, pH는 모든 생리적 환경에서 사용하기 가장 편리한 트리거하지 않을 수 있습니다. 또 다른 전통 알터입성을 달성적인 시츄 화학 중합 또는 가교 결합에 사용된다. 그룹은 암모늄 및 N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine 이루어지는 수용성 산화 환원 시스템을 개발하여 폴리에틸렌 글리콜과 폴리 (프로필렌) 9,10 글리콜 이루어지는 거대 단량체의 반응을 위해 사용했다. ZAN 외. 11 개발 주사 키토산 폴리 비닐 네트워크는 글루 타르 알데히드와 가교 결합. 이러한 시스템에서, 반응성 성분의 세포 독성은 세포, 특히 밀봉에 관련된 애플리케이션에 고려되어야한다. 또한, 발열 중합은 고분자 뼈 (12, 13)를 시멘트에 대해보고 된 주변 조직을 손상 충분히 높은 온도를 생성 할 수 있습니다.
또 다른 주사 가능한 중합체 시스템은 트리거로 온도를 고체 상태로부터 액체의 변화를 나타내는 개발되었다. thermogelling 시스템으로 알려진 이들은 aqueo 있습니다우리 현장 형성 (14)에 달성하기 위해 화학적 자극, 단량체 또는 가교제를 필요로하지 않는 폴리머 솔루션을 제공합니다. 오히려 보통 생리 온도 근처에서 발생하는 위상 변화는 물리적으로 가교 된 3 차원 네트워크의 형성을 유도한다. 이러한 플루로 닉 F127과 같은 폴록 사머은 약물 전달 15-17 세포 캡슐화 (18, 19)를 thermogelling에 가장 널리 연구 폴리머 중입니다. 그러나, 물론 이러한 겔이 생리적 조건에서 안정성이 부족한 것이 허용된다. 연구 사슬 연장 제 (20) 또는 화학적 가교제 (21, 22)를 사용하여 향상된 안정성을 증명하고있다. 그럼에도 불구하고,이 시약의 사용은 전지 밀봉 용 재료의 가능성을 제한 할 수있다.
폴리 (N- 이소 프로필)은 조직 공학 및 약물 전달 (14)에 상당한 관심을 받았다 합성 thermogelling의 중합체이다. 폴리의 수용액 (N-isoprop아크릴 아미드) (PNIPAAm)는 낮은 임계 용액 온도 (LCST)를 나타내는 일반적으로 약 32 발생 – 34 ° C (23, 24)를. LCST 아래, 물 PNIPAAm 체인 수분을. 전이 온도 이상의 중합체 독성 모노머 또는 가교 결합제를 사용하지 않고 극적인 상분리 25-27 고체 겔의 형성을 초래 소수성된다. 그러나 PNIPAAm 단독 중합체는 가난한 탄성 특성을 나타낸다 의한 소수성 (28)에 생리적 온도에서 약간의 물을 개최합니다. 본 연구에서는 효소 분해성 29 항 염증 활성 (30, 31), 및 증가 된 물 및 영양소 흡수 (32)에 대한 가능성을 제공 PNIPAAm 네트워크에 공유 콘드로이틴 설페이트를 포함하도록 선택. CS와 PNIPAAm 공중 합체는 그래프트 공중 합체 (PNIPAAm-g-CS)를 형성하는 메타 크릴 레이트 – 기능화 CS의 존재하에 단량체를 중합하여 NIPAAm 우리 실험실에서 제조 하였다. 벡공중 합체의 낮은 가교 밀도의 ause는 PNIPAAm-g-CS 인해 LCST 29 RT 중의 점성 용액 및 생리 온도에서 탄성 겔을 형성한다. 중합체 용액 인해 전환 가역성 다시 LCST보다 냉각시 유동성이된다.
우리는 PNIPAAm-g-CS 인해 기계 맞출 수있는 특성, 분해성, 인간 배아 신장 (HEK)와 cytocompatibility 293 세포 (29), 조직 공학 발판 역할을 할 수있는 잠재력을 가지고 있음을 증명하고있다. 그러나, 추간판 등의 특정 부하지지 영역에서, 조직 공학 골격은 탈구 (33)의 위험을 제거하기 위해 디스크 주변 조직과 상당한 계면을 형성 할 수있는 능력을 가져야한다. 이 인터페이스는 임플란트와 조직 (33) 사이의 인터페이스를 통해 힘의 적절한 전송을 위해 필요하다. 우리의 작업에서 우리는 중단 가지고lginate PNIPAAm-g-CS의 수용액에서의 미세 입자 및 겔화 조직 (34) 주변에 접착 성을 제공하는 미세 입자를 지역화 것을 발견했다. 본 논문에서는 thermogelling, 접착제 폴리머의 준비 단계를 설명합니다. 생존율의 표준 생체 재료 특성 세포 이미징을위한 기술 및 분석은 고려 중합체의 온도 감도와 위상 천이의 가역성을 취하도록 하였다. 이 문서에 설명 된 주사 중합체는이 문서에서 설명 된 이외의 약물 전달 및 조직 공학 응용 프로그램에 대한 다양한 가능성이있다. 또한, 여기에 설명 된 특성화 방법 thermogelling 다른 시스템들에 적용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
하이드로 겔 미세 입자 복합체를 합성하고 접착 강도를 평가, 능력 및 세포 생체 적합성을 붓기 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. PNIPAAm-g-CS의 자유 라디칼 중합은 콘드로이틴 설페이트 성공적 메타 크릴 단량체 성분을 완전히 용해 및 무산소 반응 조건을 필요로한다. 이 네이티브 추간 원판 조직 (29)과 유사한 기계적 특성을 갖는 공중 합체를 생성하기 위해, 우리의 이전 연구에서 입증 되…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 감사 접착 인장 시험 프로토콜의 개발에 박사 제니퍼 Kadlowec의 도움을 인정하고 싶습니다.
이 책에서보고 된 연구는 관절염 및 근골격계 및 피부 질환의 국립 연구소와 보너스 번호 1R15의 AR 063920-01에서 바이오 메디컬 이미징 및 국립 보건원의 생물의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
| Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
| Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
| 50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
| Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
| Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
| Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
| Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
| Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
| 70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
| DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
| Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
| Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
| Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
| Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
| XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
| Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
| Dulbecco's PBS: 1X | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
| Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
| Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips |
| No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
| Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
| Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
| Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 mL |
| FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
| Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
| Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
| Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
| 2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
| E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
| Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
| Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
| Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
| Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
| Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37°C | |
| Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
| Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
| Rocking platform | VWR | Series 100 | |
| Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
| Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
| Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |
Referencias
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