Síntesis de termogelificante poli (N-isopropilacrilamida) compuestos de sulfato de condroitina-injertado con alginato micropartículas de Ingeniería de Tejidos
Summary
Un andamio de la ingeniería de tejidos inyectable compuesto de poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina-injertado (PNIPAAm-g-CS) que contienen micropartículas de alginato se preparó. La fuerza adhesiva, propiedades de hinchamiento y es la biocompatibilidad in vitro se analizaron en este estudio. Las técnicas de caracterización desarrolladas aquí pueden ser aplicables a otros sistemas de termogelificación.
Abstract
Biomateriales inyectables se definen como materiales implantables que se pueden introducir en el cuerpo como un líquido y se solidifican in situ. Tales materiales ofrecen las ventajas clínicas de ser implantado mínimamente invasiva formando y fácilmente sólidos que llenan el espacio en defectos de forma irregular. biomateriales inyectables han sido ampliamente investigado como andamios para la ingeniería de tejidos. Sin embargo, para la reparación de ciertas áreas de soporte de carga en el cuerpo, tales como el disco intervertebral, andamios deben poseer propiedades adhesivas. Esto minimizará el riesgo de dislocación durante el movimiento y asegurar un contacto íntimo con el tejido circundante, proporcionando la transmisión adecuada de las fuerzas. Aquí, se describe la preparación y caracterización de un andamio compuesto de poli térmicamente sensible (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina-injertado (PNIPAAm-g-CS) y micropartículas de alginato. El copolímero PNIPAAm-g-CS forma una solución viscosa en agua a temperatura ambiente, en el que alginatpartículas e se suspenden para mejorar la adherencia. Por encima de la temperatura de solución crítica inferior (LCST), alrededor de 30 ° C, el copolímero forma un gel sólido alrededor de las micropartículas. Hemos adaptado procedimientos biomateriales de caracterización de tener en cuenta la transición de fase reversible de PNIPAAm-g-CS. Los resultados indican que la incorporación de partículas de alginato / ml 50 o 75 mg en 5% (w / v) soluciones PNIPAAm-g-CS cuadruplicar la resistencia a la tracción adhesiva de PNIPAAm-GCS sola (p <0,05). La incorporación de micropartículas de alginato también aumenta significativamente la capacidad de hinchamiento de PNIPAAm-g-CS (p <0,05), lo que ayuda a mantener un gel llena espacios dentro de los defectos del tejido. Por último, los resultados de la vitro kit de ensayo es toxicología, 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) 2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT) y ensayo de viabilidad Live / Dead indican que la adhesivo es capaz de soportar la supervivencia y la proliferación de encapsulado de riñón embrionario humano (HEK) 293 cells más de 5 días.
Introduction
Biomateriales inyectables son aquellos que pueden ser convenientemente presentadas en el cuerpo como un líquido y solidificar in situ. Tales materiales se han aplicado ampliamente en la medicina regenerativa, en el que se utilizan para entregar células encapsuladas para el sitio afectado 1-4 y actuar como una matriz extracelular provisional en tres dimensiones para las células 5. Para el paciente, biomateriales inyectables son ventajosas debido a que los procedimientos quirúrgicos para la implantación son mínimamente invasivos y la fase sólida puede llenar de forma irregular defectos de los tejidos, eliminando la necesidad de implantes de tamaño personalizado.
La inyectabilidad se puede lograr mediante una variedad de mecanismos. Factores externos, como pH, se han investigado como un disparador para la formación de geles que encapsulan las células y moléculas bioactivas 6-8. Sin embargo, el pH no puede ser el desencadenante más conveniente para su uso en todos los ambientes fisiológicos. Otra alterna tradicionaltivo para lograr inyectabilidad está utilizando en la polimerización química in situ o la reticulación. Un grupo desarrolló un sistema redox soluble en agua compuesto de persulfato amónico y N, N, N -tetrametiletilendiamina ', N' y lo utilizó para la reacción de compuestos macrómeros de polietilenglicol y poli (propileno) glicol 9,10. Zan et al. 11 redes quitosano alcohol polivinílico inyectables desarrollados reticuladas con glutaraldehído. En tales sistemas, la citotoxicidad de componentes reactivos se debe considerar, especialmente para aplicaciones que implican la encapsulación de células. Además, la polimerización exotérmica podría producir temperaturas suficientemente altas como para poner en peligro el tejido circundante, que se ha informado para el hueso polimérico cementos 12,13.
Todavía otros sistemas de polímeros inyectables se han desarrollado que exhiben un cambio del estado líquido al estado sólido con la temperatura como el gatillo. Conocido como sistemas termogelificantes, estos son aqueonos soluciones de polímero que no requieren estímulo químico, monómeros, agentes de reticulación o para lograr la formación in situ 14. Más bien, una transición de fase que ocurre generalmente cerca de la temperatura fisiológica induce la formación de una red tridimensional físicamente reticulado. Poloxámeros, tales como Pluronic F127 son algunos de los polímeros más ampliamente estudiados para la administración de fármacos termogelificante 15-17 y encapsulación celular 18,19. Sin embargo, es bien aceptado que estos geles carecen de estabilidad en condiciones fisiológicas. Los estudios han demostrado un aumento de la estabilidad usando alargadores de cadena o reticulantes químicos 20 21,22. Sin embargo, el uso de estos reactivos puede limitar el potencial de los materiales para la encapsulación de células.
El poli (N-isopropilacrilamida) es un polímero termogelificante sintético que ha recibido una atención significativa en la ingeniería de tejidos y la entrega de drogas 14. Las soluciones acuosas de poli (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) presentan una temperatura de solución crítica inferior (LCST), que se produce normalmente alrededor del 32 – 34ºC 23,24. Por debajo de la LCST, agua hidrata cadenas PNIPAAm. Por encima de la temperatura de transición, el polímero se convierte en hidrófobo, lo que resulta en una separación de fases dramático 25-27 y la formación de un gel sólido sin el uso de monómeros tóxicos o agentes de reticulación. Sin embargo, homopolímeros PNIPAAm exhiben propiedades elásticas pobres y tienen poca agua a temperatura fisiológica debido a la hidrofobicidad 28. En este trabajo, hemos decidido incorporar el sulfato de condroitina covalente en la red PNIPAAm, que ofrece la posibilidad de degradabilidad enzimática 29, la actividad anti-inflamatoria 30,31, y el aumento de agua y la absorción de nutrientes 32. copolímeros de PNIPAAm con CS se prepararon en el laboratorio mediante la polimerización de la NIPAAm monómero en presencia de CS metacrilato funcionalizado para formar copolímero injertado (PNIPAAm-g-CS). because de la densidad de reticulación baja del copolímero, PNIPAAm-g-CS forma una solución viscosa en agua a RT y un gel elástico a temperatura fisiológica debido a la LCST 29. Las soluciones de polímero se convierten en capaz de fluir de nuevo al enfriar por debajo de la LCST, debido a la reversibilidad de la transición.
Hemos demostrado que PNIPAAm-g-CS tiene el potencial de funcionar como un andamio ingeniería de tejidos, debido a las propiedades mecánicas que se pueden adaptar, degradabilidad, y citocompatibilidad con riñón embrionario humano (HEK) 293 células 29. Sin embargo, en ciertas áreas de soporte de carga, tales como el disco intervertebral, andamios de ingeniería de tejidos deben tener la capacidad de formar una interfaz sustancial con el tejido del disco circundante para eliminar el riesgo de dislocación 33. Esta interfaz también es necesario para la transmisión adecuada de la fuerza a través de la interfaz entre el implante y el tejido 33. En nuestro trabajo, hemos suspendido unamicropartículas lginate en soluciones acuosas de PNIPAAm-g-CS y encontraron que la gelificación localiza las micropartículas, que proporcionan la adherencia con el tejido circundante 34. En el presente trabajo se exponen los pasos para la preparación de la termogelificante, polímero adhesivo. Las técnicas estándar para la caracterización de biomateriales, imágenes de células, y ensayos de viabilidad se adaptaron a tener en cuenta la sensibilidad a la temperatura del polímero y la reversibilidad de la transición de fase. El polímero inyectable se describe en este documento tiene gran potencial para aplicaciones de administración de fármacos y la ingeniería tisular fuera de los descritos en este documento. Por otra parte, los métodos de caracterización descritos aquí pueden ser aplicables a otros sistemas de termogelificación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos críticos en la síntesis del compuesto de micropartículas de hidrogel y evaluar su fuerza adhesiva, la capacidad y la biocompatibilidad celular hinchazón. polimerización por radicales libres de PNIPAAm-g-CS requiere metacrilación exitosa de sulfato de condroitina, la disolución completa de los componentes de monómero, y las condiciones de reacción libre de oxígeno. La relación de monómero a NIPAAm sulfato de condroitina metacrilado en la mezcla de reacción fue elegido porque se ha demostrado…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean expresar su agradecimiento por la asistencia del Dr. Jennifer Kadlowec en el desarrollo del protocolo de ensayo de tracción adhesiva.
Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel y el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el premio número 1R15 AR 063920-01. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
| Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
| Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
| 50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
| Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
| Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
| Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
| Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
| Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
| 70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
| DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
| Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
| Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
| Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
| Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
| XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
| Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
| Dulbecco's PBS: 1X | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
| Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
| Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips |
| No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
| Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
| Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
| Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 mL |
| FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
| Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
| Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
| Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
| 2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
| E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
| Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
| Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
| Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
| Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
| Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37°C | |
| Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
| Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
| Rocking platform | VWR | Series 100 | |
| Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
| Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
| Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |
Referencias
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