Sintesi di Thermogelling poli (N-isopropilacrilammide) -graft-condroitin solfato compositi con alginato microparticelle per ingegneria dei tessuti
Summary
Un iniettabili impalcatura ingegneria tissutale composta da poli (N-isopropilacrilammide) solfato -graft-condroitina (PNIPAAm-g-CS) contenenti, microparticelle di alginato è stato preparato. La forza adesiva, gonfiore proprietà e de biocompatibilità vitro vengono analizzati in questo studio. Le tecniche di caratterizzazione sviluppate qui possono essere applicabili ad altri sistemi thermogelling.
Abstract
Biomateriali iniettabili sono definiti come materiali impiantabili che possono essere introdotte nel corpo come un liquido e solidificano in situ. Tali materiali offrono i vantaggi clinici di essere impiantati minimamente invasivo e facilmente formare solidi spazio-riempimento in difetti di forma irregolare. biomateriali iniettabili sono stati ampiamente studiati come scaffold per l'ingegneria tissutale. Tuttavia, per la riparazione di alcune zone portanti nel corpo, quale il disco intervertebrale, scaffold dovrebbero possedere proprietà adesive. Ciò minimizza il rischio di lussazione durante il movimento e assicurare un contatto intimo con il tessuto circostante, fornendo adeguata trasmissione delle forze. Qui, descriviamo la preparazione e caratterizzazione di un ponteggio composto termicamente poli sensibili (N-isopropilacrilammide) solfato -graft-condroitina (PNIPAAM-g-CS) e microparticelle di alginato. Il copolimero PNIPAAm-g-CS forma una soluzione viscosa in acqua a temperatura ambiente, in cui alginate le particelle sono sospese per migliorare l'adesione. Sopra la temperatura della soluzione critica inferiore (LCST), circa 30 ° C, il copolimero forma un gel solido intorno alle microparticelle. Abbiamo adattato procedure biomateriali caratterizzazione tipo per tener conto della transizione di fase reversibile PNIPAAm-g-CS. I risultati indicano che l'incorporazione di particelle di alginato / ml 50 o 75 mg in 5% (w / v) soluzioni PNIPAAm-g-CS quadruplicare la forza adesiva alla trazione di PNIPAAm-gCS alone (p <0.05). L'incorporazione di microparticelle di alginato incrementa notevolmente la capacità di rigonfiamento PNIPAAm-g-CS (p <0,05), contribuendo a mantenere un gel che riempiono lo spazio all'interno difetti del tessuto. Infine, i risultati della vitro tossicologia kit de assay, 2,3-bis- (2-metossi-4-nitro-5-solfofenil) -2H-tetrazolio-5-carboxanilide (XTT) e test di vitalità Live / Morto indicano che il adesivo è in grado di supportare la sopravvivenza e la proliferazione di incapsulato rene embrionale umano (HEK) 293 cells oltre 5 giorni.
Introduction
Biomateriali iniettabili sono quelli che possono essere presentate convenientemente nel corpo come un liquido e solidificare in situ. Tali materiali sono stati applicati estesamente nella medicina rigenerativa, dove sono utilizzati per fornire cellule incapsulate al sito interessato 1-4 e fungere da matrice extracellulare temporanea tridimensionale per le celle 5. Per il paziente, biomateriali iniettabili sono vantaggiosi in quanto le procedure chirurgiche per l'impianto sono minimamente invasiva e la fase solida può riempire di forma irregolare difetti del tessuto, eliminando la necessità per gli impianti di formato personalizzato.
Iniettabilità può essere realizzato attraverso una varietà di meccanismi. Fattori esterni, come pH, sono state studiate come innesco per la formazione di gel che incapsulano cellule e molecole bioattive 6-8. Tuttavia, pH non può essere la causa più comodo da usare in tutti gli ambienti fisiologici. Un altro alterna tradizionaletivo per realizzare iniettabilità utilizza in situ polimerizzazione chimica o reticolazione. Un gruppo ha sviluppato un sistema redox idrosolubile composta di persolfato di ammonio e N, N, N -tetramethylethylenediamine ', N' e utilizzato per reagire macromeri composti di glicole polietilene e poli (propilene) glicole 9,10. Zan et al. 11 reti sviluppate iniettabili chitosano polivinilalcool reticolati con glutaraldeide. In tali sistemi, la citotossicità dei componenti reattivi deve essere considerato, in particolare per applicazioni che prevedono l'incapsulamento delle cellule. Inoltre, polimerizzazione esotermica potrebbe produrre alte temperature sufficienti a compromettere il tessuto circostante, che è stato segnalato per l'osso polimerico cementi 12,13.
Ancora altri sistemi polimerici iniettabili sono stati sviluppati che presentano un cambiamento dal liquido allo stato solido con temperatura del grilletto. Conosciuto come sistemi thermogelling, questi sono aqueonoi soluzioni polimeriche che non richiedono chimici stimolo, monomeri o reticolanti per ottenere formazione in situ 14. Piuttosto, una transizione di fase solito si verificano a temperatura fisiologica induce la formazione di un reticolo tridimensionale fisicamente reticolato. Poloxamers quali Pluronic F127 sono tra i polimeri più ampiamente studiato per la somministrazione di farmaci thermogelling 15-17 e cellule incapsulamento 18,19. Tuttavia, è ben accettato che questi gel mancano stabilità alle condizioni fisiologiche. Gli studi hanno dimostrato una maggiore stabilità con estensori di catena 20 o reticolanti chimici 21,22. Tuttavia, l'uso di questi reagenti può limitare il potenziale dei materiali per incapsulamento della pila.
Poli (N-isopropilacrilammide) è un polimero sintetico thermogelling che ha ricevuto notevole attenzione in ingegneria dei tessuti e Drug Delivery 14. Le soluzioni acquose di poli (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) presentano una temperatura più bassa soluzione critica (LCST), di solito si verificano intorno a 32 – 34 ° C 23,24. Sotto il LCST, acqua idrata catene PNIPAAm. Sopra la temperatura di transizione, il polimero diventa idrofoba, causando un drammatico separazione di fase 25-27 e formazione di un gel solido senza l'uso di monomeri tossici o reticolanti. Tuttavia, omopolimeri PNIPAAm mostrano scarse proprietà elastiche e tengono po 'd'acqua a temperatura fisiologica a causa di idrofobicità 28. In questo lavoro, abbiamo scelto di integrare condroitin solfato covalente nella rete PNIPAAm, che offre la possibilità di degradabilità enzimatica 29, attività anti-infiammatoria 30,31, e una maggiore acqua e l'assorbimento dei nutrienti 32. copolimeri PNIPAAm con CS sono stati preparati nel nostro laboratorio mediante la polimerizzazione del monomero NIPAAm in presenza di metacrilato-funzionalizzato CS per formare copolimero graffato (PNIPAAm-g-CS). because della bassa densità di reticolazione del copolimero, PNIPAAm-g-CS forma una soluzione viscosa in acqua a temperatura ambiente e un gel elastico a temperatura fisiologica causa della LCST 29. Le soluzioni polimeriche diventano fluido nuovo per raffreddamento sotto la LCST dovuta alla reversibilità della transizione.
Abbiamo dimostrato che PNIPAAm-g-CS ha il potenziale per funzionare come un impalcatura ingegneria dei tessuti, a causa delle proprietà meccaniche che possono essere adattati, degradabilità e citocompatibilità con reni embrionali umane (HEK) 293 cellule 29. Tuttavia, in alcune zone portanti, come il disco intervertebrale, tessuto scaffold ingegneria dovrebbero avere la capacità di formare una interfaccia sostanziale con tessuto discale circostante per eliminare il rischio di lussazione 33. Questa interfaccia è necessaria anche per un'adeguata trasmissione della forza attraverso l'interfaccia tra l'impianto e il tessuto 33. Nel nostro lavoro, abbiamo sospeso unmicroparticelle lginate in soluzioni acquose di PNIPAAm-g-CS e ha scoperto che la gelificazione localizza le microparticelle, che forniscono l'adesione con il tessuto circostante 34. In questo lavoro, si delineano i passaggi per la preparazione del thermogelling, polimero adesivo. tecniche standard per biomateriali caratterizzazione, imaging cellulare, e saggi di redditività sono stati adattati per tener conto della sensibilità alla temperatura del polimero e la reversibilità della transizione di fase. Il polimero iniettabile descritto in questo documento ha un ampio potenziale per le applicazioni di consegna della droga e ingegneria dei tessuti al di fuori di quelle descritte in questo documento. Inoltre, i metodi di caratterizzazione qui descritti possono essere applicabili ad altri sistemi thermogelling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi passaggi critici nella sintesi composito idrogel-microparticelle e valutare la sua forza adesiva, gonfiore capacità, e biocompatibilità cellulare. polimerizzazione radicalica del PNIPAAm-g-CS richiede methacrylation successo di condroitin solfato, completa dissoluzione dei componenti monomerici, e le condizioni di reazione priva di ossigeno. Il rapporto tra NIPAAm monomero condroitin solfato metacrilato nella miscela di reazione è stato scelto perché è stato dimostrato, nel nostro lavoro precedente,…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere con gratitudine l'aiuto del Dr. Jennifer Kadlowec nello sviluppo del protocollo di collante prove di trazione.
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Institute of Arthritis e muscoloscheletrico e malattie della pelle e l'Istituto Nazionale di Biomedical Imaging e Bioingegneria del National Institutes of Health sotto Premio Numero 1R15 AR 063.920-01. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
| Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
| Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
| 50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
| Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
| Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
| Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
| Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
| Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
| 70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
| DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
| Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
| Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
| Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
| Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
| XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
| Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
| Dulbecco's PBS: 1X | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
| Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
| Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips |
| No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
| Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
| Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
| Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 mL |
| FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
| Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
| Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
| Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
| 2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
| E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
| Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
| Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
| Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
| Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
| Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37°C | |
| Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
| Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
| Rocking platform | VWR | Series 100 | |
| Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
| Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
| Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |
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