Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

Summary

Um andaime engenharia de tecidos injectáveis ​​compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina–graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Abstract

Biomateriais injectáveis são definidos como materiais implantáveis que podem ser introduzidos no corpo como um líquido e solidificar in situ. Tais materiais oferecem as vantagens clínicas de serem implantados minimamente invasiva e facilmente formando sólidos de preenchimento de espaço em defeitos de forma irregular. biomateriais injetáveis ​​têm sido amplamente investigados como suportes para engenharia de tecidos. No entanto, para a reparação de determinadas zonas de suporte de carga no corpo, tais como o disco intervertebral, andaimes devem possuir propriedades adesivas. Isto vai minimizar o risco de deslocamento durante o movimento e assegurar o contacto íntimo com o tecido circundante, fornecendo a transmissão adequada das forças. Aqui, descrevemos a preparação e caracterização de um andaime composto por termicamente sensíveis poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina -graft-(PNIPAAm-g-CS) e micropartículas de alginato. O copolímero de PNIPAAm-g-CS forma uma solução viscosa em água à TA, em que alginate as partículas são suspensas para aumentar a adesão. Acima da temperatura crítica inferior de solução (TCIS), cerca de 30 ° C, o copolímero forma um gel sólido em volta das micropartículas. Temos adaptado biomateriais procedimentos normalizados de caracterização para tomar em consideração a transição de fase reversível de PNIPAAm-g-CS. Os resultados indicam que a incorporação de 50 ou 75 mg / ml de partículas de alginato em 5% (w / v) de soluções PNIPAAm-g-CS quadruplicar a resistência à tracção adesiva de PNIPAAm-GCS sozinhos (p <0,05). A incorporação de micropartículas de alginato também aumenta significativamente a capacidade de inchamento de PNIPAAm-g-CS (p <0,05), ajudando a manter um gel de enchimento dentro do espaço de defeitos de tecidos. Finalmente, os resultados do ensaio in vitro kit de toxicologia, 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida (XTT) e ensaio de viabilidade vivo / morto indicam que o adesivo é capaz de suportar a sobrevivência e proliferação de encapsulado de rim embrionário humano (HEK) 293 Cells mais de 5 dias.

Introduction

Biomateriais injectáveis são aqueles que podem ser convenientemente entregues para o corpo como um líquido e solidificar in situ. Tais materiais têm sido extensivamente aplicado na medicina regenerativa, em que eles são utilizados para entregar células encapsuladas para o local afectado ^1-4 e actuam como uma matriz extracelular temporária tridimensional para as células ^5. Para o paciente, biomateriais injectáveis ​​são vantajosos porque os procedimentos cirúrgicos para implante são minimamente invasiva e a fase sólida pode preencher defeitos de forma irregular dos tecidos, eliminando a necessidade de implantes de tamanho personalizado.

Injectabilidade pode ser conseguido através de uma variedade de mecanismos. Os factores externos, como pH, têm sido investigadas como um gatilho para a formação de geles que encapsulam as células e moléculas bioactivas ^6-8. No entanto, o pH não pode ser o gatilho mais conveniente para utilizar em todos os ambientes fisiológicos. Outra alterna tradicionaltiva para atingir injectabilidade está usando polimerização in situ química ou reticulação. Um grupo desenvolvido um sistema redox solúvel em água composto por persulfato de amónio e N, N, N-tetrametiletilenodiamina, N ', e é utilizado para a reacção de macrómeros compostas de polietileno glicol e poli (propileno) glicol ^9,10. Zan et al. ¹¹ redes quitosano injectáveis de álcool polivinílico reticulado com glutaraldeído desenvolvidos. Em tais sistemas, a citotoxicidade dos componentes reactivos deve ser considerada, especialmente para aplicações que envolvem o encapsulamento celular. Além disso, a polimerização exotérmica pode produzir temperaturas elevadas o suficiente para comprometer o tecido circundante, o que tem sido relatado para o osso polimérico cimentos ^12,13.

Ainda outros sistemas de polímeros injectáveis ​​têm sido desenvolvidos que exibem uma mudança do estado líquido para estado sólido com a temperatura como o gatilho. Conhecido como sistemas termogelificantes, estes são aqueonos soluções de polímero que não requerem estímulo químico, monómeros ou agentes de ligação cruzada para conseguir a formação in situ ^14. Em vez disso, uma transição de fase que ocorre geralmente próxima da temperatura fisiológica induz a formação de uma rede tridimensional fisicamente reticulado. Poloxâmeros como Pluronic F127 estão entre os polímeros mais estudados para termogelificantes entrega da droga ^15-17 e células encapsulamento ^18,19. No entanto, é bem aceite que estes geles não possuem a estabilidade em condições fisiológicas. Estudos têm demonstrado o aumento da estabilidade usando extensores de cadeia ou agentes de reticulação químicos ^{20 21,22.} No entanto, a utilização destes reagentes pode limitar o potencial dos materiais de encapsulamento de células.

Poli (N-isopropilacrilamida) é um polímero sintético termogelificantes que tem recebido uma atenção significativa em engenharia de tecidos e entrega de droga ^14. As soluções aquosas de poli (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) exibem uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), tipicamente ocorrendo em torno de 32-34 ° C ^23,24. Abaixo da TCIS, água hidrata cadeias de PNIPAAm. Acima da temperatura de transição, o polímero torna-se hidrofóbico, resultando numa separação de fases dramática ^25-27 e formação de um gel sólido, sem o uso de monómeros ou agentes de reticulação tóxicos. No entanto, homopolímeros de PNIPAAm exibem pobres propriedades elásticas e mantenha pouco de água à temperatura fisiológica devido à hidrofobicidade ^28. Neste trabalho, nós optar por incorporar sulfato de condroitina covalente na rede PNIPAAm, que oferece o potencial para degradabilidade enzimática ^29, a actividade anti-inflamatória ^30,31, e aumento da água e absorção de nutrientes ^32. copolímeros de PNIPAAm com CS foram preparados no nosso laboratório por polimerização do monómero NIPAAm na presença de CS-metacrilato funcionalizado para formar copolímero enxertado (PNIPAAm-g-CS). BecAUtilize de baixa densidade de reticulação do copolímero, PNIPAAm-g-CS forma uma solução viscosa em água à TA, e um gel elástico à temperatura fisiológica devido à TCIS ^29. As soluções de polímero se tornar fluido novamente após o arrefecimento abaixo da TCIS, devido à reversibilidade da transição.

Nós demonstramos que PNIPAAm-g-CS tem o potencial para funcionar como uma estrutura de engenharia de tecidos, devido às propriedades mecânicas que podem ser adaptados, degradabilidade e citocompatibilidade com rim embrionário humano (HEK) 293 células ^29. No entanto, em determinadas áreas de suporte de carga, tais como o disco intervertebral, andaimes de engenharia de tecidos devem possuir a capacidade de formar uma interface substancial com o tecido envolvente do disco para eliminar o risco de deslocamento ^33. Esta interface é também necessário para uma adequada transmissão de força em toda a interface entre o implante e o tecido ^33. Em nosso trabalho, temos que suspendeu amicropartículas lginate em soluções aquosas de PNIPAAm-g-CS e descobriram que a gelificação localiza as micropartículas, que proporcionam a adesão com o tecido circundante ^34. Neste artigo, vamos delinear os passos para a preparação do termogelificantes, polímero adesivo. As técnicas convencionais para a caracterização de biomateriais, imagens de células, e os ensaios de viabilidade foram adaptados para ter em conta a sensibilidade à temperatura do polímero e a reversibilidade da transição de fase. O polímero injetável descrito neste trabalho tem grande potencial para aplicações de entrega de medicamentos e engenharia de tecidos fora dos descritos neste documento. Além disso, os métodos de caracterização descritos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Protocol

1. O poli (N-isopropilacrilamida) -g-sulfato de condroitina Síntese Antes da síntese do hidrogel bioadesivo, purificar N-isopropilacrilamida (NIPAAm) e monómero de metacrilato de sulfato de condroitina (CS). Pesar, pelo menos, 10 g de NIPAAm e dissolve-se o monómero em 400 ml de n-hexano a 60 ° C. Agita-se o recipiente periodicamente até à dissolução completa. Recristaliza-se a solução num congelador a -20 ° C durante 24 h. Remover o monómero cristalizado a partir de o filtro e…

Representative Results

Um co-polímero enxertado de resposta térmica foi sintetizado com sucesso e caracterizado pela sua força bioadesiva, propriedades de intumescimento, e em citocompatibilidade vitro. Nós escolhemos para investigar alginato devido às suas propriedades mucoadesivas bem estabelecidos. As micropartículas de alginato, com um diâmetro médio de 59,7 ± 14,9 uM, foram misturados com 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS, em concentrações de 25, 50, e 75 mg / ml. Estas concentrações …

Discussion

Há vários passos críticos em sintetizar o composto hidrogel-micropartículas e avaliar a sua força adesiva, inchaço capacidade e biocompatibilidade celular. polimerização de radical livre de PNIPAAm-g-CS requer metacrila��o bem sucedida de sulfato de condroitina, a dissolução completa dos componentes de monómero, e das condições de reacção sem oxigénio. A razão de monómero para NIPAAm sulfato de condroitina metacrilado na mistura de reacção foi escolhida porque foi demonstrado, no nosso trab…

Materials

N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized	Acros Organics	2210-25-5	Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea)	Sigma-Aldrich	39455-18-0	Refrigerate
Hexanes	Fisher Scientific	H302-4	Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS254-1	Caustic in nature
Methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	276685	Strong fumes; use in a fume hood
Acetone	Fisher Scientific	A18-4	Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas	Praxair	7727-37-9	Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure	Acros Organics	110-18-9
Ammonium persulfate	Sigma Aldrich	A3678	Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets	Fisher Scientific	BP2944	Keep dry
Alginic acid, sodium salt	Acros Organics	177775000	Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79
Canola oil	Local store		Obtain from a local store
Tween 20	Sigma-Aldrich	93773
70% (v/v) Isopropoanol	Fisher Scientific	A416-4
Porcine ears	Haine's Pork Shop		Obtain from a local butcher
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Human embryonic kidney 293 cells	ATCC	ATCC CRL-1573	Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1X, high glucose, no pyruvate	Life Technologies	11965126	Refrigerate
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082-147	Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml	Life Technologies	15140-122	Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10X	Life Technologies	15400-054	Refrigerate
Methanol	VWR	AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit	Life Technologies	L3224	Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit	Sigma Aldrich	TOX2-1KT	Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1X, high glucose, no phenol	Life Technologies	21063-029	Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1X	Life Technologies	14190136	Refrigerate
Sodium citrate	EMD	SX0445-1
Positive displacement pipette	BrandTech Scientific, INC	2702904	Dispenses 100 – 500 µL and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle	Sigma Aldrich	S2896
Miltex sterile surgical blades	Fisher Scientific	12-460-440	Size 10
Power gem homogenizer	Fisher Scientific	08-451-660	Model # 125
Porcelain mortar and pestle	Sigma Aldrich	Z247464	Holds 50 mL
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system	Labconco	7740020	Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump	Edwards	A65301906	Model # RV5
Incubating orbital shaker	VWR	12620-946	Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge	Forma Scientific, INC		Model # 5682
Heated ovens	VWR		Model # 1235PC
2 N force gauge	Shimpo	FGV-0.5XY	Model # FGV-0.5XY
E-force test stand	Shimpo	FGS-200PV	Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge	Beckman Coulter	366830	Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge	Eppendorf		Model #5415C
Hemacytometer set	Hausser Scientific	3720	Requires replacement cover glass slips
Slide warmer	Lab Scientific	XH-2022	Model # XH-2002
Portable heating lamp	Underwriters Laboratories		Helps to maintain polymer temperature at 37°C
Inverted fluorescent microscope	Zeiss		Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath	VWR		Model # 1235PC
Rocking platform	VWR		Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader	Thermo Scientific		Type 357
Cell culture incubator	VWR		Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet	Labconco		Delta Series