كشف اللاعبين الرئيسيين من الحصانة Humoral: متقدم ومحسن اللمفاويات العزلة البروتوكول من بقع الفاري بير في
Summary
في هذه الدراسة، نقدم على بروتوكول فعال لعزل الخلايا الليمفاوية ورواية من البقع في بير (PPs)، التي يمكن أن تستخدم بعد ذلك لفحوصات الوظيفية في الجسم الحي وفي المختبر ، فضلا عن دراسات سيتوميتريك تدفق من تي جرابي مساعد وخلايا مركز جيرمنال ب.
Abstract
في مخاطية القناة الهضمية، تشكل الخلايا المناعية كيان مناعية فريدة، التي تعزز التسامح المناعي بينما وفي الوقت نفسه منح الدفاع محصنة ضد مسببات الأمراض. ومن الثابت أن البقع في بير (PPs) دوراً أساسيا في شبكة المخاطي محصنة باستضافة عدة المستجيب T وخلية بمجموعات فرعية. شريحة معينة من هذه الخلايا المستجيب، ومساعد تي الحبيبي (طفح) ومركز جيرمنال (GC) ب الخلايا هي إضفاء الطابع المهني في تنظيم الحصانة humoral. ومن ثم فإن وصف هذه المجموعات الفرعية خلية داخل المركز الصحفي من حيث التمييز بين البرنامج والخصائص الوظيفية يمكن أن توفر معلومات هامة حول حصانة المخاطي. وتحقيقا لهذه الغاية، سيكون طريقة المطبق بسهولة وكفاءة واستنساخه من اللمفاويات في معزل عن المكتب الصحفي قيمة للباحثين. في هذه الدراسة، ونحن تهدف إلى إيجاد وسيلة فعالة لعزل الخلايا الليمفاوية من المكتب الصحفي للماوس مع خلية عالية الغلة. نهجنا كشفت أن النسيج الأولية المعالجة مثل استخدام الكواشف الجهاز الهضمي والتهيج الأنسجة، فضلا عن الخلية المصبوغة الظروف واختيار لوحات جسم، يكون له تأثير كبير على نوعية وهوية لمفاوية معزولة وعلى النتائج التجريبية.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول تمكن الباحثين كفاءة عزل السكان اللمفاويات من المكتب الصحفي للسماح بتدفق استنساخه التقييم القائم على الخلوي لمجموعات فرعية تي وخلية بتركز أساسا على مجموعات فرعية خلية طفح وب GC.
Introduction
هو زينت الجهاز الهضمي كامل من البداية إلى النهاية مع شبكة اللمفاوية واسعة النطاق الذي يحتوي على الخلايا المناعية أكثر من أي جهاز في الإنسان والفأر1. بير بقع (PPs) تشكل عنصرا رئيسيا لفرع هذه المنظمة المناعية الخلوية، ما يسمى الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية (جالت)2،3في الأمعاء. داخل المركز الصحفي، آلاف ملايين مستضدات المشتقة من المواد الغذائية، الحجمية commensal ومسببات الأمراض التي يتم أخذ عينات باستمرار، وعندما تكون الاستجابات المناعية المناسبة اللازمة تجاهها المناعة المعوية وبالتالي الحفاظ على محمل التوازن. وفي هذا المعني، ذكر المكتب الصحفي يمكن أن يطلق عليه اسم “اللوزتين الأمعاء الدقيقة”. ذكر المكتب الصحفي تتكون من الأقسام الفرعية الرئيسية: قبة سوبيبيثيليال (SED)، مناطق المسام ب-خلية كبيرة؛ السطحية المرتبطة جريب ظهارة (FAE) ومنطقة إينتيرفوليكولار (أي إف آر) حيث تكون خلايا تي يقع4. ويمنح هذا التقسيم الفريد من المكتب الصحفي المستجيب مختلفة تمكن الخلية مجموعات فرعية للتعاون، وبالتالي، السيلينيوم في القناة الهضمية.
ذكر المكتب الصحفي انعدام اللمفاوي الزبائ، ونظرا لهذا السبب، يجري المستضدات تنقل إلى الصحفي من الأمعاء لا عن طريق الأوعية اللمفاوية خلافا لمعظم الأجهزة اللمفاوية الأخرى. بدلاً من ذلك، الخلايا الظهارية المتخصصة الموجودة في صناديق النشاط الخاص، ما يسمى م الخلايا، المسؤولة عن نقل المستضدات لومينال إلى الصحفي5. وفي وقت لاحق، يتم انتقاؤها المستضدات المنقولة بالخلايا الجذعية (DCs) والبالعات التي تقع في منطقة قبة سوبيبيثيليال (SED) تحت6،FAE7. عملية الفرز هذه مستضد بوحدات تحكم المجال Dc في PP أمر حاسم لبدء الاستجابة المناعية التكيفية8 والجيل اللاحق من الخلايا المبيضي إيغا9.
نظراً للعبء الثقيل مستضدي من كومينسال النباتات والمواد الغذائية، المضيف الصحفي اندوجينوسلي المنشط المستجيب T وخلية بمجموعات فرعية في وفرة كبيرة مثل طفح وب GC إيغا+ الخلايا10، مما يوحي بأن المكتب الصحفي تمثيل موقع للمناعة النشطة 11من الاستجابة. كشف ليصل إلى 20-25% طفح خلايا CD4 مجموع+ تي الخلية المقصورة ويصل إلى 10 – 15% ب GC الخلايا داخل الخلايا ب المجموع هو ممكن في المكتب الصحفي لجمعها من الفئران C57BL/6 الشباب المطعمين12. خلافا لسائر أنواع الخلايا مساعد تي (أي.، Th1، Th2، خلايا Th17)، تظهر الخلايا طفح انتحاء فريدة من نوعها في المسام خلية باساسا بسبب التعبير CXCR5، الذي يعزز طفح الخلية صاروخ موجه على طول التدرج CXCL1313. في مناطق المسام خلية ب PPs، حمل الخلايا طفح جزئ تبديل فئة إيغا وهايبرموتيشن جسدية في تنشيط الخلايا ب من التي تميز عالية تقارب إيغا إنتاج خلايا14. وفي وقت لاحق، هذه الخلايا البلازما إفراز جسم تهاجر إلى بروبريا الصفيحة (ليرة لبنانية) وتنظيم التوازن المناعي في الأمعاء10.
تحديد وتوصيف طفح وب GC السكان خلية داخل المركز الصحفي قد تمكن الباحثين من التحقيق في ديناميات خلطيه الاستجابات المناعية تحت ظروف حالة ثابتة دون الحاجة إلى نماذج التحصين مضيعة للوقت تستخدم تقليديا في “ب” طفح-GC خلية الدراسات15،16،،من1718. تحليل الخلايا طفح داخل المكتب الصحفي غير مباشرة كمجموعات فرعية خلية أخرى. وتشمل التحديات التقنية تحديد الأنسجة مثالية إعداد الشروط، سطح جسم-علامة الجمع، فضلا عن تحديد الضوابط المناسبة الإيجابية والسلبية. حقول البحث طفح و PP يحمل تقلبات كبيرة من حيث الإجراءات التجريبية وهي أبعد ما تكون عن منح توافق في آراء وضع بروتوكولات موحدة لأسباب عدة. أولاً، يميل كل خلية فرعية داخل المكتب الصحفي خلطات متأثرة بظروف إعداد الأنسجة التي تحتاج إلى مزيد من التعديلات في طريقة فرعية محددة خلية. ثانيا، هناك اختلاف كبير بين طرق الإبلاغ عنها فيما يتعلق بتفاصيل إعداد الخلية من “لالصحفي. الثالثة”، العدد الدراسات المقارنة على أساس بروتوكول التحقيق تقنيات إعداد الأنسجة مثالية والظروف التجريبية PP وطفح البحث محدودا نوعا ما.
الدراسات الحالية المستندة إلى بروتوكول اقترح PP خلية إعداد19،20،21،22 لم تكن طفح-أو GC المنحى الخلية ب. وعلاوة على ذلك، تم العثور على بعض شروط إعداد الأنسجة الموصى بها للصحفي19،20 مثل الهضم المستندة إلى كولاجيناز تؤثر على نتائج تحديد الهوية طفح بالتدفق الخلوي سلبا على18. وعلى هذا الأساس، نحن مسبب أن بروتوكولا الأمثل وموحد وقابل لإعادة الإنتاج التي يمكن استخدامها لدراسة ديناميات خلية طفح وب GC داخل المكتب الصحفي قيمة بالنسبة للمحققين الذين يعملون على هذا الموضوع. هذه الحاجة أعطانا الحافز لتوليد بروتوكولا محسنة وحديثة لعزل وتوصيف لمفاوية PP ناعما محسن لاسترداد الخلوي وصلاحية وكفاءة لتدفق سيتوميتريك توصيف عدة تي وب مجموعات فرعية من الخلية. نحن تهدف أيضا إلى استبعاد عدة خطوات إعداد شاقة اقترح في البروتوكولات السابقة، وبالتالي الحد من التلاعب المطلوب والوقت لإعداد الخلايا والأنسجة من المكتب الصحفي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يمكننا وصف بروتوكول الأمثل لتدفق سيتوميتريك توصيف الخلايا طفح وب GC. واحدة من المزايا الرئيسية لأن البروتوكول أنه يمكن عزل يصل إلى 107 (متوسط 4 – 5 × 106 خلايا) مجموع الخلايا PP من ماوس واحدة (سلالة C57BL/6) دون أي عملية الهضم. لاحظنا أن الخلية إجمالي العائد كان ارتباطاً إيجابيا مع عد…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر لورا شتراوس وبيتر حكيم لإجراء مناقشات مفيدة ودعم مع التدفق الخلوي التحليلات.
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
Referencias
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells – Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
