שחקני המפתח unraveling Humoral חסינות: מתקדם וממוטב לימפוציט בידוד פרוטוקול טלאים מאתר של Peyer
Summary
במחקר זה, אנו מציגים הרומן ונוהל יעיל הבידוד של לימפוציטים מ טלאים של פייה (PPs), בו ניתן להשתמש לאחר מכן ב- vivo ו- in vitro לקשרי מבחני פונקציונלי, כמו גם מחקרים cytometric זרימה של הזקיקים T עוזר, מרכז נבטי B תאים.
Abstract
ברירית המעיים, תאים חיסוניים מהווים ישות אימונולוגי ייחודי, אשר מקדם עמידות מערכת החיסון בזמן במקביל היוועצות ההגנה החיסונית נגד פתוגנים. היא מבוססת היטב כי התיקונים של פייה (PPs) יש תפקיד חיוני הרירית ברשת מערכת החיסון על ידי אירוח מספר אפקטור T ו B cell קבוצות משנה. חלק מסוים של אפקטור תאים אלה, הזקיקים T helper (TFH) ותאי B מרכז נבטי (GC) הם professionalized בוויסות humoral חסינות. לפיכך, אפיון אלה קבוצות משנה תא בתוך PPs במונחים של בידול התוכנית ומאפייני פונקציונלי שלהם יכול לספק מידע חשוב על חסינות הרירית. לשם כך, שיטה ישימה בקלות, יעיל ו לשחזור של לימפוציטים בידוד מ- PPs יהיה ערך לחוקרים. במחקר זה, כיוונו כדי ליצור שיטה יעילה כדי לבודד לימפוציטים מן העכבר PPs עם תשואה גבוהה התא. הגישה שלנו חשף את הרקמה הראשונית הזאת עיבוד בהן: ריאגנטים העיכול ועצבנות רקמות, כמו גם תא מכתימים תנאים ומבחר של נוגדן פאנלים, יש השפעה רבה על איכות ועל זהות של לימפוציטים מבודד תוצאות הניסוי.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר לחוקרים ביעילות לבודד לימפוציט אוכלוסיות מ- PPs ומאפשר זרימה לשחזור מבוססי cytometry הערכה של קבוצות משנה T ו- B cell, התמקדות בעיקר TFH ו- GC B תא קבוצות משנה.
Introduction
מערכת העיכול כולה מההתחלה עד הסוף הוא עדיין עם מערך הלימפה המכילה תאים חיסוניים יותר מכל איבר-אנוש אחרים, העכבר1. Peyer של טלאים (PPs) מהווים מרכיב מרכזי של הענף מעיים של הארגון מערכת החיסון התאית, כביכול הקשורים הבטן רקמת הלימפה (גולט)2,3. בתוך PPs, אלפי מיליוני אנטיגנים נגזר חומרים תזונתיים, commensal microbiota, פתוגנים הם להיות שנדגמו ברציפות, כאשר הצורך תגובות מערכת החיסון המתאים כלפיהם הם הנטען החיסון במעי ובכך שמירה הומאוסטזיס. במובן הזה, PPs יכול להיקרא בשם כמו “השקדים של המעי הדק”. PPs מורכב תאי משנה עיקריים: כיפת subepithelial (SED), אזורים גדולים תא B זקיק; אפיתל זקיק-הקשורים שמעליה (מיסטי) ואזור interfollicular (למעלה) איפה ממוקם4תאי T. מידור ייחודית זו של PPs מאפשר אפקטור שונים תא קבוצות משנה לשתף פעולה, לפיכך, מקנה immunocompetence בבטן.
PPs חסרה lymphatics מביא, בשל סיבה זו, אנטיגנים מועבר PPs מן המעי הדק שלא מתנהלים דרך כלי הלימפה בניגוד למרבית איברי הלימפה אחרים. במקום זאת, תאים אפיתל מיוחדים ממוקם מיסטי, תאי M כביכול, אחראים העברת אנטיגנים luminal לתוך PPs5. לאחר מכן, אנטיגנים מועבר הן נאספות על ידי התאים הדנדריטים (Dc) ו phagocytes הממוקמים באזור כיפת subepithelial (SED) מתחת מיסטי6,7. תהליך המיון זה אנטיגן על-ידי בקרי ב PP חיוני ליזום תגובה חיסונית אדפטיבית8 ו דור עוקבות של תאים מפרישים איגה9.
בשל העומס antigenic כבד של פלורה commensal והחומרים התזונתיים, המארח PPs endogenously מופעל אפקטור T ו- B cell קבוצות משנה ב- abundances גדול כגון TFH ו- B GC איגה+ תאים10, רומז כי PPs מייצגים אתר של החיסון הפעיל תגובה11. זיהוי של עד 20 – 25% TFH תאים בתוך CD4 הכולל+ T תא תא ו למעלה עד 10 – 15% GC B תאים בתוך תאי B הכולל אפשרית ב- PPs שנאסף unimmunized צעיר C57BL/6 עכברים12. לעומת סוגים אחרים של תא מסייע T (כלומר., Th1, Th2, תאים Th17), תאים TFH להראות tropism ייחודי אל תוך זקיקי תא B בעיקר בשל ביטוי CXCR5, המקדם TFH יונת תא לאורך מעבר הצבע CXCL1313. באזורי זקיק תא B של PPs, תאים TFH זירוז איגה הכיתה לעבור רקומבינציה, היפרמוטציה בתאי B מופעל שממנו גבוהה-זיקה איגה לייצר תאים להבדיל14. לאחר מכן, אלו תאים פלזמה מפריש נוגדן להגר פרופריה. מוסקולריס (LP), לווסת את המערכת החיסונית הומאוסטזיס בטן10.
זיהוי ואפיון של אוכלוסיות תאים TFH ו- GC B בתוך PPs עשויה לאפשר לחוקרים לחקור את הדינמיקה של תגובות חיסוניות ההורמונאלית בתנאים מצב יציב ללא הצורך של מודלים התחסנות זמן רב משמשת גם TFH-GC B תא מחקרים15,16,17,18. ניתוח TFH תאים בתוך PPs אינה ברורים ככל קבוצות משנה אחרים בתא. האתגרים הטכניים כוללים זיהוי הרקמה אידיאלי הכנה תנאים, שילוב השטח נוגדן-marker, וכן בחירת הפקדים המתאימים חיוביים ושליליים. תחומי מחקר TFH ו- PP התערוכה שונות רבה במועדי מבחינת נהלים ניסיוני, רחוקים היוועצות קונצנזוס להקים פרוטוקולים סטנדרטיים בשל מספר סיבות. ראשית, משנה תא בתוך PPs נוטה להיות מושפעים באופן שונה על ידי רקמת הכנה מצבים הדורשים שינויים נוספים באופן ספציפי משנה תא. שנית, קיים פער משמעותי בין השיטות המדווחת לגבי הפרטים של הכנה תא מ השלישי ול-pps , המספר של מחקרים השוואתיים מבוססי פרוטוקול חוקרת טכניקות להכנת רקמות האידיאלית והתנאים ניסיוני עבור עמודים ו- TFH מחקר מוגבל למדי.
מחקרים נוכחיים מבוססי פרוטוקול, הציע PP תא הכנה19,20,21,22 לא היו TFH – או GC מונחה תא B. יתר על כן, כמה תנאים רקמות הכנה מומלצת PPs19,,20 , כגון עיכול מבוססי collagenase נמצאו משפיעים על התוצאות של זיהוי TFH מאת cytometry זרימה שלילית18. על בסיס זה, אנחנו הסיק כי פרוטוקול ממוטבת, סטנדרטית ו לשחזור שיכול לשמש בחקר דינמיקה תא TFH ו- GC B בתוך PPs יהיה יקר בפני החוקרים עובדים על נושא זה. הצורך הזה נתן לנו את הדחף ליצור פרוטוקול ועדכני של שיפור עבור בידוד ואפיון של לימפוציטים PP דק הממוטב עבור שחזור הסלולר, הכדאיות ויעילות זרימת cytometric פלואורסנציה מספר T ו- B תא קבוצות משנה. גם כיוונו כדי לא לכלול מספר צעדים הכנה מפרך המוצעת פרוטוקולים הקודמים, ובכך, להפחית את המניפולציות נדרש והשעה עבור הכנת הרקמה והתא מ- PPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אופטימיזציה עבור זרימת cytometric אפיון TFH ותאי GC B. אחד היתרונות הגדולים של פרוטוקול שלנו הוא שהם מאפשרים את ניתוקה של עד 107 (ממוצע 5-4 x 106 תאים) הכולל PP תאים מן עכבר אחת (זן C57BL/6) ללא כל תהליך העיכול. הבחנו כי התשואה cell סך הכל היה בקורלציה עם המספר של PPs, יכול להי…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו תודה לורה שטראוס ומרווה פיטר לדיונים מועיל ולתמוך עם ניתוחים cytometry זרימה.
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
Referencias
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells – Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
