Desentrañando los jugadores claves de inmunidad Humoral: avanzada y Protocolo de aislamiento de linfocitos de parches Murine placas de Peyer
Summary
En este estudio, presentamos un novedoso y eficaz protocolo para el aislamiento de los linfocitos de las placas de Peyer (PP), que pueden utilizarse posteriormente para ensayos funcionales en vivo y en vitro como en estudios de citometría de flujo folicular t helper y células del centro germinal B.
Abstract
En la mucosa intestinal, células inmunes constituyen una entidad única de la inmunológica, que promueve la tolerancia inmunológica mientras que al mismo tiempo que confiere defensa inmune contra patógenos. Está bien establecido que placas de Peyer (PPs) tienen un papel esencial en la red inmune mucosa alojando varios efectoras T y células B subconjuntos. Una cierta fracción de estas células efectoras, ayudante T folicular (TFH) y las células de B de centro germinal (CG) se profesionalizó en la regulación de la inmunidad humoral. Por lo tanto, la caracterización de estos subconjuntos de la célula dentro de PPs en términos de su programa de diferenciación y propiedades funcionales puede proporcionar información importante sobre inmunidad mucosa. Para ello, un método fácilmente aplicable, eficiente y reproducible de aislamiento de linfocitos de PPs sería valioso para los investigadores. En este estudio, el objetivo fue generar un método efectivo para aislar los linfocitos de ratón PPs con rendimiento alto de la célula. Nuestro enfoque reveló ese tejido inicial procesamiento tales como el uso de reactivos digestivos y agitación de tejido, así como coloración condiciones y selección de los paneles de anticuerpos de la célula, tienen gran influencia en la calidad y la identidad de los linfocitos aislados y en resultados experimentales.
Aquí, describimos un protocolo permitiendo a los investigadores aislar eficientemente las poblaciones de linfocitos de PPs permitiendo reproducible flujo cytometry-evaluación de subconjuntos de T y células B centrándose principalmente en TFH y GC B subconjuntos de la célula.
Introduction
Todo el tracto gastrointestinal desde el principio hasta el final se viste de gala con una extensa red linfoide que contiene las células inmunes más que cualquier otro órgano humano y ratón1. Peyer de parches (PPs) constituyen un componente importante de la sección intestinal de esta organización celular inmune, llamado tejido linfoide asociado a intestino (GALT)2,3. En PPs, miles de millones de antígenos derivados de materiales alimenticios, patógenos y microbiota comensal que se muestrean continuamente, y cuando es necesarias respuestas inmunes adecuadas hacia ellos están montado así mantener inmune intestinal homeostasis. En ese sentido, PPs podría ser nombrado como “amígdalas del intestino”. PPs consisten en compartimientos secundarios principales: cúpula subepitelial (SED), grandes zonas de folículos de células B; el epitelio suprayacente asociado folículo (FAE) y región interfollicular (IFR) donde las células T están ubicados4. Esta compartimentalización único de PPs permite subconjuntos de células efectoras diferentes a cooperar, por lo tanto, confiere inmunocompetencia en el intestino.
PPs carecen de vasos linfáticos aferentes, y por esta razón, antígenos transportados a PPs de intestino delgado no se están realizando a través de vasos linfáticos en contraste con la mayoría de los otros órganos linfoides. En cambio, las células epiteliales especializadas en FAE, llamadas células M, son responsables de la transferencia de antígenos luminales en el PPs5. Posteriormente, se recogen los antígenos transportados por las células dendríticas (DCs) y los fagocitos que se encuentran en la región de cúpula subepitelial (SED) debajo de la FAE6,7. Este proceso de clasificación de antígeno por DCs en el PP es crucial para iniciar la respuesta inmune adaptativa8 y posterior generación de IgA secretoras células9.
Debido a la pesada carga antigénica de flora comensal y del material alimenticio, PPs host endógeno activado efectoras T y células B subconjuntos en gran abundancia como células TFH y IgA+ GC B10, sugiriendo que el PPs representar un sitio de inmune activa respuesta11. Detección de hasta 20 – 25% células TFH en total CD4+ T compartimiento de la célula y hasta 10 – 15% GC B células dentro de células B totales es posible en PPs obtenidos de ratones C57BL/6 jóvenes inmunizados12. En contraste con otros tipos de células del ayudante de T (es decir., Th1, Th2, Th17 células), TFH células muestran tropismo singular en los folículos de células B principalmente debido a CXCR5 expresión, que promueve la TFH celular autoguiado hacia el blanco a lo largo de la gradiente de CXCL1313. En las zonas de folículos de células B de PPs, las células de la TFH inducir IgA clase interruptor de recombinación y la hipermutación somática en células B activadas que las células productoras de IgA de alta afinidad diferencian14. Posteriormente, estas células plasmáticas secretoras de anticuerpos migran a la lámina propia (LP) y regular la homeostasis inmune en la tripa10.
Identificación y caracterización de poblaciones celulares TFH y B GC dentro de PPs podrían permiten a los investigadores a investigar la dinámica de la respuesta inmune humoral bajo condiciones de estado estacionario sin la necesidad de modelos de inmunización desperdiciador de tiempo utilizado tradicionalmente en TFH-GC B celular estudios15,16,17,18. Analizando las células de la TFH en PPs no es tan fácil como otros subconjuntos de la célula. Desafíos técnicos incluyen la identificación de condiciones de preparación de tejido ideal, combinación de anticuerpo-marcador superficial, así como seleccionar los controles positivos y negativos adecuados. Campos de investigación TFH y PP muestran gran variabilidad en términos de procedimientos experimentales y están lejos de conferir un consenso para establecer protocolos estandarizados debido a varias razones. En primer lugar, cada subconjunto celular en PPs tiende a ser afectados diferencialmente por las condiciones de preparación de tejido que requieren más modificaciones de manera de subconjunto específico de célula. En segundo lugar, existe una discrepancia significativa entre los métodos reportados con respecto a los detalles de preparación de la célula de PPS. tercero, el número de estudios comparativos basados en el protocolo de investigación de técnicas de preparación de tejido ideal y condiciones experimentales para el PP y TFH investigación es bastante limitada.
Los estudios actuales basados en el protocolo sugeridos por PP celular preparación19,20,21,22 no eran TFH o GC orientado a la célula de B. Por otra parte, se encontraron algunas condiciones de preparación de tejido recomendados PPs19,20 como base de colagenasa digestión afectar negativamente el resultado de la identificación de TFH por citometría de flujo18. Sobre esta base, razonamos que un protocolo optimizado, estandarizado y reproducible que puede utilizarse para estudiar la dinámica celular TFH y B GC en PPs sería valioso para los investigadores trabajando sobre este tema. Esta necesidad nos dio el impulso para generar un protocolo mejorado y actualizado para el aislamiento y la caracterización de los linfocitos PP que finalmente está optimizado para la recuperación celular, viabilidad y eficiencia para la caracterización de citometría de flujo de varios T y B subconjuntos de la célula. También decidimos excluir varios pasos de preparación laboriosa sugeridos en anteriores protocolos, por lo tanto, reducir las manipulaciones necesarias y tiempo para la preparación de tejidos y células de PPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un protocolo optimizado para caracterización de citometría de flujo de células TFH y B GC. Una de las principales ventajas de nuestro protocolo es que permite el aislamiento de hasta 107 (promedio 4 a 5 x 106 células) total PP las células de un ratón (cepa C57BL/6) sin ningún proceso digestivo. Observamos que el rendimiento total de la célula se correlacionó positivamente con el número de PPs y que podría estimarse de la siguiente ecuación simple que es útil para la p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Laura Strauss y Peter Sage para discusiones útiles y ayuda con los análisis de citometría de flujo.
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
Referencias
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