Humoral bağışıklık çözülen anahtar oyuncular: gelişmiş ve lenfosit yalıtım antikorundan Peyer's yamalar iletişim kuralından en iyi duruma getirilmiş
Summary
Bu çalışmada, biz bir roman ve lenfositlerin izolasyonu için etkili iletişim kuralı Peyer’s yamalar (PPs), daha sonra in vivo ve in vitro fonksiyonel deneyleri için hem de akış sitometrik çalışmalar foliküler t kullanılabilir sunmak yardımcı ve germinal Merkez B hücreleri.
Abstract
Bağırsak mukoza bağışıklık hücreleri bağışıklık toleransı aynı anda patojenlere karşı bağışıklık savunma veriyor ise teşvik benzersiz bir immünolojik varlık oluşturmaktadır. De Peyer’s yamalar (PPs) önemli bir rol mukozal bağışıklık ağ çeşitli efektör T ve B hücre alt kümeleri barındırarak sahip kuruldu. Bu efektör hücreleri, foliküler T helper (TFH) ve germinal Merkez (GC) B hücreleri belirli bir kısmını humoral bağışıklık Yönetmelikte professionalized. Bu nedenle, farklılaşma programı ve fonksiyonel özellikleri açısından bu hücre alt kümeleri-PPs içinde karakterizasyonu mukozal bağışıklık hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bu amaçla, PPs lenfosit izolasyon kolayca uygulanabilir, verimli ve tekrarlanabilir bir yöntemin araştırmacılar için değerli olacaktır. Bu çalışmada, lenfositler yüksek hücre verim ile fare PPs dan izole etmek için etkili bir yöntem oluşturmak amaçlanmıştır. Bizim yaklaşım o ilk doku doku ajitasyon ve sindirim reaktifler kullanımı gibi işleme ortaya hem de hücre boyama koşulları ve antikor paneller yelpazesi, kalite ve kimlik izole lenfositler ve üzerinde büyük etkisi var deneysel sonuçlar.
Burada, verimli bir şekilde tekrarlanabilir akış sitometresi tabanlı değerlendirilmesi T ve B hücre alt kümeleri öncelikle TFH ve GC B hücre alt kümeleri üzerinde odaklanarak izin PPs lenfosit nüfus yalıtmak araştırmacılar sağlayan bir protokol açıklayın.
Introduction
Sonunda tüm gastrointestinal sistem başından itibaren daha fazla organ insan ve fare1bağışıklık hücreleri içeren geniş bir lenfoid ağ ile katlı olduğunu. Peyer’s yamalar (PPs) teşkil bu hücresel bağışıklık organizasyon, sözde gut ilişkili lenfoid doku (GALT)2,3bağırsak dalı önemli bir bileşeni. PPs, diyet malzemelerden türetilmiş antijenleri milyonlarca binlerce içinde komensal microbiota ve patojenler sürekli örnek ve ne zaman gerekli uygun bağışıklık yanıtı onlara doğru takılı böylece bakımı bağırsak bağışıklık vardır homeostazı. Bu anlamda, PPs “ince bağırsak bademcikler” adlandırılabilir. PPs oluşan büyük alt bölmeler: subepithelial kubbe (SED), büyük B hücreli folikül bölgeleri; üstteki folikül ilişkili epitel (FAE) ve interfollicular bölgesi (IFR) nerede bulunduğu4T hücreleri vardır. İşbirliği için PPs sağlar farklı efektör hücre alt kümeleri benzersiz bu compartmentalization böylece, immunocompetence gut confers.
PPs afferent Lenfleribile eksikliği ve bu nedenle, PPs için ince bağırsak nakli antijenleri lenfoid diğer organları aksine lenf damarları aracılığıyla yürütülmektedir değil. Bunun yerine, FAE, sözde M hücreleri, bulunan özel epitel hücreler luminal antijenleri transfer PPs5içine sorumludur. Daha sonra taşınan antijenleri dendritik hücreler (DC) tarafından toplanır ve fagositler FAE6,7altında subepithelial kubbe (SED) bölgesinde yer alır. Bu antijen sıralama işlemi DCs PP tarafından edinilmiş bağışıklık yanıtı8 ve IgA salgılayan hücreler9sonraki nesil başlatmak çok önemlidir.
Komensal flora ve diyet malzeme ağır antijenik yükü nedeniyle, PPs ana bilgisayar endogenously efektör T ve B hücre alt kümeleri TFH ve IgA+ GC B hücreleri10gibi büyük zenginliği içinde PPs bir sitenin aktif bağışıklık temsil ettiğini düşündüren aktive Yanıt11. Algılama % 20-25’e kadar toplam CD4 TFH hücrelerde+ T hücre bölmesi ve yukarı GC B hücreleri içindeki toplam B hücreleri % 10-15 unimmunized genç C57BL/6 fareler12toplanan PPs mümkündür. Aksine diğer T yardımcı hücresi türleri (i.e., Th1, Th2, Th17 hücreleri), TFH hücreleri B hücre köklerinin öncelikle TFH hücre posta CXCL13 degrade13boyunca teşvik CXCR5 ifade sayesinde içine benzersiz tropism gösterir. PPs B hücre folikül bölgelerinde, IgA sınıf anahtar rekombinasyon ve içinden14yüksek afinite IgA üreten hücreleri ayırt aktif B hücrelere somatik Hipermutasyon TFH hücreleri neden. Daha sonra bu antikor salgılayan plazma hücreleri lamina propria (LP) göç ve gut10bağışıklık homeostazı düzenler.
TFH ve GC B hücre popülasyonlarının PPs içinde malzemelerin kimlik ve humoral bağışıklık yanıtı zaman alıcı bağışıklama modelleri gerek kalmadan kararlı durum koşullarda dinamikleri araştırmak araştırmacılar etkinleştirmek geleneksel olarak kullanılan TFH-GC B hücre çalışmaları15,da16,17,18. PPs hücrelerde TFH çözümlemeleri diğer hücre alt kümeleri olarak kadar basit değil. Teknik sorunlar ideal doku hazırlık koşulları, yüzey antikor-marker kombinasyonu, tanımlama yanı sıra uygun pozitif ve negatif denetimleri seçme içerir. TFH ve PP araştırma alanları deneysel prosedürler açısından büyük değişkenlik gösterir ve uzak veriyor çeşitli nedenlerden dolayı standart iletişim kuralları kurmak için bir fikir birliği vardır. İlk olarak, PPs içindeki her hücre alt doku hazırlık koşulları daha da bir hücre alt özgü şekilde değişiklik yapılmasını gerektiren differentially etkilenecek eğilimindedir. İkinci olarak, detayları hücre hazırlık üzerinden üçüncü PPS, karşılaştırmalı çalışmalar iletişim kuralı-based araştırma ideal doku hazırlama teknikleri ve deneysel koşullar sayısı hakkında bildirilen yöntemler arasında önemli bir tutarsızlık var s ve TFH için araştırma oldukça sınırlı kalıyor.
PP hücre hazırlık19,için20,21,22 önerdi mevcut iletişim kuralı-based çalışmalar TFH – ya da GC B hücre yönelik değildi. Ayrıca, PPs19,20 collagenase tabanlı sindirim gibi için önerilen bazı doku hazırlık koşullar TFH tespiti sonucu akış sitometresi tarafından olumsuz yönde etkileyecek bulunmuştur18. Bu temelde, TFH ve GC B hücre dinamiği içinde PPs çalışma için kullanılan bir en iyi duruma getirilmiş, standart ve tekrarlanabilir protokol bu konu üzerinde çalışan araştırmacılar için değerli olacağını gerekçeli. Bu ihtiyacı bize yalıtım ve ince hücresel kurtarma, canlılık ve verimlilik akış sitometrik karakterizasyonu birkaç T ve B için en iyi şekilde PP lenfositler karakterizasyonu için geliştirilmiş ve güncel bir protokol oluşturmak için bir ivme verdi hücre alt kümeleri. Biz de önceki Protokoller’de, böylece, önerilen birkaç zahmetli hazırlık adımları dışlamak için gerekli işlemler ve doku ve hücre hazırlık PPs dan için zamanı azaltmak amaçlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, akış sitometrik karakterizasyonu TFH ve GC B hücreleri için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklayın. Bizim Protokolü’nün en büyük avantajlarından biri herhangi bir sindirim süreci en çok 107 (ortalama 4 – 5 x 106 hücreler) Toplam PP hücre tek bir fare (C57BL/6 zorlanma) yalıtım sağlar olduğunu. Biz toplam hücre verim olumlu PPs numarası ile ilişkili ve deneysel planlama için yararlı olan aşağıdaki basit denklemi tahmin edilebilir gözlenen: “Toplam PP h…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Akış Sitometresi Analizi ile destek ve Laura Strauss ve Peter adaçayı yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
Referencias
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells – Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
